Адам ағзасындағы антитромбин ақуызы

Кіріспе

Homo sapiens-те кездесетін сүтқоректілердің ақуызы.

Антитромбин (АТ) – қан ұю жүйесінің бірнеше ферменттерін тежеуге қабілетті шағын гликопротеин. Бұл бауырда өндірілетін 464 аминқышқылынан тұратын ақуыз. Онда үш дисульфидтік байланыс және жалпы алты гликозилдеу орны бар. α-Антитромбин – қан плазмасында кең таралған антитромбиннің басым түрі, оның төрт гликозилдеу орнының әрқайсысы олигосахаридпен толған. Антитромбиннің аз таралған түрі β-антитромбинде гликозилдеу орнының біреуі тұрақты түрде бос болып қалады. Гепарин антикоагулянтты дәрісі антитромбиннің ІІа факторға (тромбин) және Ха факторға байланысуын күшейте отырып, оның активтілігін еселеп арттырады.

Құрылымы

Антитромбин сондай-ақ антитромбин III (АТ III) деп те аталады. I антитромбин мен IV антитромбин атаулары 1950 жылдары Сигерс, Джонсон және Фелл жүргізген алғашқы зерттеулерден бастау алады. I антитромбин (IАТ) – тромбиннің фибриногенді белсендіргеннен кейін, фибринге катализдік емес байланыс орнында тромбинмен байланысуын білдіреді. Антитромбин II (АТ II) – плазмадағы кофактор, ол гепаринмен бірге тромбин мен фибриногеннің өзара әрекеттесуіне кедергі келтіреді. Антитромбин III (АТ III) – тромбинді инактивациялайтын плазмадағы зат. IV антитромбин (IVАТ) – қан ұю кезінде және одан кейін белсендірілетін антитромбин. Тек АТ III және, мүмкін, АТ I ғана медициналық маңызға ие. АТ III көбінесе тек "антитромбин" деп аталады және осы мақалада антитромбин III талқыланады. Антитромбиннің қан плазмасындағы жартылай өмір сүру мерзімі шамамен 3 күнге жетеді. Адам қан плазмасындағы антитромбиннің қалыпты концентрациясы шамамен 0,12 мг/мл, бұл 2,3 мкМ молярлық концентрацияға тең. Антитромбин адамдардан басқа көптеген түрлердің плазмасынан бөліп алынған. Белок және кДНҚ тізбегін анықтау нәтижесінде сиыр, қой, қоян және тышқан антитромбиндерінің барлығы 433 аминқышқылынан тұрады, бұл адам антитромбинінен бір аминқышқылымен ұзын. Қосымша аминқышқылы 6-шы аминқышқылының орнында орналасқан деп есептеледі. Сиыр, қой, қоян, тышқан және адам антитромбиндерінің аминқышқылдық тізбегінің 84-89% бірдей. Алты аминқышқылы үш молекулалық дисульфидтік байланыстарды құрайды: Cys8-Cys128, Cys21-Cys95 және Cys248-Cys430. Олардың барлығында N-гликозилдеудің төрт потенциалды орны бар. Бұл орындар адамда аспарагин (Asn) аминқышқылдарының 96, 135, 155 және 192 нөмірінде, ал басқа түрлерде осыған ұқсас аминқышқылдарда кездеседі. Бұл орындардың барлығы адам антитромбинінің басым түрінде, α-антитромбинде, ковалентті байланысқан олигосахаридтік тізбектермен толтырылған, нәтижесінде осы антитромбин түрінің молекулалық салмағы 58 200-ге жетеді. Адамның қалыпты антитромбиніне ұқсас қасиеттері бар рекомбинантты антитромбиндер бактериялық вирустың жұқтырған жәндік жасушаларын және жасуша мәдениетінде өсірілген сүтқоректілердің жасушаларын қолдану арқылы өндірілген. Бұл рекомбинантты антитромбиндер әдетте қалыпты антитромбиннен гликозилдеу үлгісімен ерекшеленеді және антитромбиннің құрылымдық зерттеулерінде қолданылады. Осы себепті ақуыздық деректер банкінде сақталған және осы мақалада ұсынылған антитромбин құрылымдарының көпшілігі өзгермелі гликозилдеу үлгілерін көрсетеді. Антитромбин өзінің туа бастапқы күйінде басталады, ол жасырын күйімен салыстырғанда жоғары еркін энергияға ие, ол орташа есеппен 3 күннен кейін ыдырайды. Жасырын күй белсенді күймен бірдей, яғни тромбиннің тежелуіне қатысады. Осылайша, бұл белоктың бүктелуінің кинетикалық және термодинамикалық бақылауының классикалық мысалы болып табылады.

Antithrombin is also termed antithrombin III (AT III). The designations antithrombin I through to antithrombin IV originate in early studies carried out in the 1950s by Seegers, Johnson and Fell. Antithrombin I (AT I) refers to the binding of thrombin to fibrin, after thrombin has activated fibrinogen, at a non catalytic binding site of thrombin. Antithrombin II (AT II) refers to a cofactor in plasma, which together with heparin interferes with the interaction of thrombin and fibrinogen. Antithrombin III (AT III) refers to a substance in plasma that inactivates thrombin. Antithrombin IV (AT IV) refers to an antithrombin that becomes activated during and shortly after blood coagulation. Only AT III and possibly AT I are medically significant. AT III is generally referred to solely as "antithrombin" and it is antithrombin III that is discussed in this article. Antithrombin has a half life in blood plasma of around 3 days. The normal antithrombin concentration in human blood plasma is high at approximately 0.12 mg/ml, which is equivalent to a molar concentration of 2.3 μM. Antithrombin has been isolated from the plasma of a large number of species additional to humans. As deduced from protein and cDNA sequencing, cow, sheep, rabbit and mouse antithrombins are all 433 amino acids in length, which is one amino acid longer than human antithrombin. The extra amino acid is thought to occur at amino acid position 6. Cow, sheep, rabbit, mouse, and human antithrombins share between 84 and 89% amino acid sequence identity. Six of the amino acids form three intramolecular disulfide bonds, Cys8 Cys128, Cys21 Cys95, and Cys248 Cys430. They all have four potential N glycosylation sites. These occur at asparagine (Asn) amino acid numbers 96, 135, 155, and 192 in humans and at similar amino acid numbers in other species. All these sites are occupied by covalently attached oligosaccharide side chains in the predominant form of human antithrombin, α antithrombin, resulting in a molecular weight for this form of antithrombin of 58,200. Recombinant antithrombins with properties similar to those of normal human antithrombin have been produced using baculovirus infected insect cells and mammalian cell lines grown in cell culture. These recombinant antithrombins generally have different glycosylation patterns to normal antithrombin and are typically used in antithrombin structural studies. For this reason many of the antithrombin structures stored in the protein data bank and presented in this article show variable glycosylation patterns. Antithrombin begins in its native state, which has a higher free energy compared to the latent state, which it decays to on average after 3 days. The latent state has the same form as the activated state that is, when it is inhibiting thrombin. As such it is a classic example of the utility of kinetic vs thermodynamic control of protein folding.

Функция

Антитромбин – серпин (серин протеаза ингибиторы) және осылайша құрылымы жағынан альфа 1 антихимотрипсин, альфа 2 антиплазмин және гепарин кофакторы II сияқты плазмадағы басқа протеаза ингибиторларына ұқсас. Антитромбиннің физиологиялық мақсатты протеазалары – контакттық активация жолының (бұрынғы ішкі жол) элементтері, атап айтқанда, Х (Ха) факторының, IX (ІХа) факторының, XI (XІА) факторының, XII (XІІа) факторының және көбінесе ІІ (тромбин) факторының (ІІа) белсендірілген түрлері, сондай-ақ тіндік фактор жолынан (бұрынғы сыртқы жол) VII (VIIа) факторының белсендірілген түрі. Ингибитор сонымен қатар қан ұюына қатысатын калликрейн мен плазминды да белсенділіктен шығарады. Дегенмен, ол коагуляцияға қатысы жоқ басқа серин протеазаларын, мысалы, трипсин мен классикалық комплемент жолындағы C1 ферментінің C1s суббөлімшесін де инактивациялайды. Протеазаның инактивациясы антитромбинмен эквимолярлы кешенге түсуі нәтижесінде болады, онда протеаза ферментінің белсенді орны оның әдеттегі субстратына қолжетімді болмайды. Алайда, P3-P4 және P1'-P2' байланыстары нейтрофильдік эластаза және бактериялық фермент термолизинмен тез үзіледі, нәтижесінде белсенді емес антитромбиндер тромбин активтілігін тежеуге қабілетсіз болады. Антитромбиннің протеаза активтілігін тежеу жылдамдығы гепаринге қосымша байланысуымен және нейтрофильдік эластазамен инактивациялануымен айтарлықтай артады. Гепарин қатысуында антитромбиннің тромбинге қарсы инактивациялау жылдамдығы 1.5–4 x 107 М−1 с−1 дейін жетеді, яғни реакция 2000–4000 есе жеделдеді. Х-факторды тежеу гепарин қатысуында 500–1000 есе ғана жеделдеді, ал максималды жылдамдық константасы тромбинге қарсы тежеуден 10 есе төмен. Бір механизм бойынша IXa және Xa факторларын гепаринмен тежеу реактивті орталықтың циклын қамтитын антитромбиннің конформациялық өзгеруіне байланысты және ол аллостериялық болып табылады. Тромбинге қарсы тежеудің басқа механизмі АТ III, тромбин және гепарин арасындағы үштік кешеннің қалыптасуына байланысты. Гепарин болмаған жағдайда реактивті орталықтан алынған P14 және P15 аминқышқылы (3-суретте көрсетілген) белоктың негізгі бөлігіне (әсіресе бета-парақтың жоғарғы бөлігіне) енгізілген. Бұл қасиет гепарин кофакторы II, альфа 1 антихимотрипсин және MENT сияқты басқа серпиндерге тән. IXa және Xa факторларын тежеу үшін ең маңызды конформациялық өзгеріс реактивті орталықтың N-терминалды аймағындағы P14 және P15 аминқышқылының қатысуын қамтиды (4-суреттегі B моделінде шеңберленген). Бұл аймақ «ілмек аймағы» деп аталады. Гепаринмен байланысуға жауап ретінде ілмек аймағындағы конформациялық өзгеріс P14 және P15 аминқышқылын белоктың негізгі бөлігінен шығаруға әкеледі, және бұл конформациялық өзгерістің алдын алу IXa және Xa факторларын тежеуді күшейтпейді. Бұл антитромбин мен тромбиннің бір-біріне жақын орналасқан гепарин тізбегіне байланысуы керек деген талапқа байланысты деп есептеледі. Мұны 5-суретте көрсетілген модельдер сериясынан көруге болады. 5-суретте көрсетілген құрылымдарда реактивті орталықтың C-терминалды бөлігі (P' жағы) басқа белсендірілмеген немесе гепаринмен белсендірілген антитромбин құрылымдарымен салыстырғанда кеңейтілген конформацияда болады. 5-суреттегі антитромбиннің ілмек аймағы конформациялық икемділігіне байланысты модельдеуге келмейді, ал P9-P14 аминқышқылы бұл құрылымда көрінбейді. Бұл конформациялық икемділік кешен ішінде P14-P15 реактивті орталық циклы енгізілген антитромбин конформациясы мен P14-P15 реактивті орталық циклы шығарылған конформациясы арасында тепе-теңдік болуы мүмкін екенін көрсетеді. Бұған дәлел ретінде 5-суреттегі кешендегі (B моделінде белгіленген) P15 Gly орналасуын талдау оның A бета-парағына енгізілгенін көрсетеді (C моделіне қараңыз). Екі антитромбин арасындағы диссоциациялық константаның айырмашылығы 3-суретте көрсетілген пентасахарид үшін үш есе, ал толық гепарин үшін он еседен артық, β-антитромбиннің байланысу қабілеті жоғары. β-антитромбиннің жоғары байланысу қабілеті бастапқы гепаринмен байланысқан кезде белок ішінде конформациялық өзгерістердің жылдамдығы артуымен байланысты деп есептеледі. α-антитромбин үшін Asn 135 деңгейіндегі қосымша гликозилдеу бастапқы гепаринмен байланысу процесіне кедеріс келтірмейді, бірақ кез келген конформациялық өзгерістерді тежейді.

Antithrombin is a serpin (serine protease inhibitor) and is thus similar in structure to most other plasma protease inhibitors, such as alpha 1 antichymotrypsin, alpha 2 antiplasmin and Heparin cofactor II. The physiological target proteases of antithrombin are those of the contact activation pathway (formerly known as the intrinsic pathway), namely the activated forms of Factor X (Xa), Factor IX (IXa), Factor XI (XIa), Factor XII (XIIa) and, to a greater extent, Factor II (thrombin) (IIa), and also the activated form of Factor VII (VIIa) from the tissue factor pathway (formerly known as the extrinsic pathway). The inhibitor also inactivates kallikrein and plasmin , also involved in blood coagulation. However it inactivates certain other serine proteases that are not involved in coagulation such as trypsin and the C1s subunit of the enzyme C1 involved in the classical complement pathway. Protease inactivation results as a consequence of trapping the protease in an equimolar complex with antithrombin in which the active site of the protease enzyme is inaccessible to its usual substrate. However, bonds P3 P4 and P1' P2' can be rapidly cleaved by neutrophil elastase and the bacterial enzyme thermolysin, respectively, resulting in inactive antithrombins no longer able to inhibit thrombin activity. The rate of antithrombin's inhibition of protease activity is greatly enhanced by its additional binding to heparin, as is its inactivation by neutrophil elastase. The rate of antithrombin thrombin inactivation increases to 1.5 4 x 107 M−1 s−1 in the presence of heparin, i. e. the reaction is accelerated 2000 4000 fold. Factor Xa inhibition is accelerated by only 500 to 1000 fold in the presence of heparin and the maximal rate constant is 10 fold lower than that of thrombin inhibition. In one mechanism heparin stimulation of Factor IXa and Xa inhibition depends on a conformational change within antithrombin involving the reactive site loop and is thus allosteric. In another mechanism stimulation of thrombin inhibition depends on the formation of a ternary complex between AT III, thrombin, and heparin. In the absence of heparin, amino acids P14 and P15 (see Figure 3) from the reactive site loop are embedded within the main body of the protein (specifically the top of beta sheet A). This feature is in common with other serpins such as heparin cofactor II, alpha 1 antichymotrypsin and MENT. The conformational change most relevant for Factor IXa and Xa inhibition involves the P14 and P15 amino acids within the N terminal region of the reactive site loop (circled in Figure 4 model B). This region has been termed the hinge region. The conformational change within the hinge region in response to heparin binding results in the expulsion of P14 and P15 from the main body of the protein and it has been shown that by preventing this conformational change, increased Factor IXa and Xa inhibition does not occur. This is thought to be due to a requirement that antithrombin and thrombin must bind to the same heparin chain adjacent to each other. This can be seen in the series of models shown in Figure 5. In the structures shown in Figure 5 the C terminal portion (P' side) of the reactive site loop is in an extended conformation when compared with other un activated or heparin activated antithrombin structures. The hinge region of antithrombin in the Figure 5 complex could not be modelled due to its conformational flexibility, and amino acids P9 P14 are not seen in this structure. This conformational flexibility indicates an equilibrium may exist within the complex between a P14 P15 reactive site loop inserted antithrombin conformation and a P14 P15 reactive site loop expelled conformation. In support of this, analysis of the positioning of P15 Gly in the Figure 5 complex (labelled in model B) shows it to be inserted into beta sheet A (see model C). The difference in dissociation constant between the two is threefold for the pentasaccharide shown in Figure 3 and greater than tenfold for full length heparin, with β antithrombin having a higher affinity. The higher affinity of β antithrombin is thought to be due to the increased rate at which subsequent conformational changes occur within the protein upon initial heparin binding. For α antithrombin, the additional glycosylation at Asn 135 is not thought to interfere with initial heparin binding, but rather to inhibit any resulting conformational changes.

Кемшіліктер

Антитромбиннің қалыпты қан ұюын реттеудегі маңызды рөлін дәлелдейтін деректер, тұқым қуалайтын немесе пайда болған антитромбин тапшылығы мен кез келген зардап шеккен адамда тромбоз ауруының қаупінің артуы арасындағы байланыста көрінеді. Антитромбин тапшылығы көбінесе пациент қайталанатын веноздық тромбоз бен өкпелік эмболияға шалдыққанда анықталады.

Табылған антитромбин тапшылығы

Антитромбин тапшылығы үш ерекше механизмнің нәтижесінде дамиды. Бірінші механизм – протеинуриямен қатар жүретін нефротикалық синдроммен байланысты бүйрек жеткіліксіздігі кезінде экскрецияның жоғарылауы. Екінші механизм – бауыр жеткіліксіздігі немесе цирроз, немесе мерзімінен бұрын тууға байланысты дамымаған бауыр кезінде өндірістің төмендеуінен туындайды. Үшінші механизм – жылдам тұтыну, ол ауыр жарақаттар мен жарақаттану салдарынан ең айқын байқалады, бірақ ірі хирургиялық операциялар немесе жүрек-өкпе айналып өту сияқты араласулар нәтижесінде де аз дәрежеде кездесуі мүмкін.

Тұқым қуалайтын антитромбин тапшылығы

Тұрақты халық арасында тұқым қуалайтын антитромбин тапшылығының жиілігі 1:2000 мен 1:5000 аралығында бағаланған, ал тұқым қуалайтын антитромбин тапшылығынан зардап шеккен алғашқы отбасы 1965 жылы сипатталған. Кейіннен, функционалдық және иммунохимиялық антитромбин талдауларына сүйене отырып, тұқым қуалайтын антитромбин тапшылығын I немесе II типке жіктеу ұсынылды. Қан ұю протеаздарын тиімді тежеу үшін антитромбин активтілігінің қалыпты функционалдық деңгейдің кемінде 70% құрауы қажет. Әдетте, I немесе II типті антитромбин тапшылығы салдарынан функционалдық антитромбин деңгейі қалыпты деңгейдің 50% төменге дейін төмендейді.

I типтегі антитромбин тапшылығы

I типтегі антитромбин тапшылығы – зардап шеккен адамдардың қанында антитромбин белсенділігінің және антитромбин концентрациясының төмендеуімен сипатталады. I типтегі тапшылық бастапқыда гепаринге жақындығына байланысты Ia және Ib екі кіші топқа бөлінді. Ia тобындағы адамдардың антитромбині гепаринге қалыпты жақындық көрсетсе, Ib тобындағы адамдардың антитромбині гепаринге жақындығы төмендеген. Кейінірек 1b жағдайларының функционалдық талдауы олардың гепаринге жақындығы төмендегенін ғана емес, сонымен қатар реактивті орынға, гепарин байланыс орнына және антитромбиннің қандағы концентрациясына әсер ететін көптеген немесе «плейотроптық» бұзылыстарға тап болды. Халықаралық тромбоз және гемостаз қоғамының ғылыми және стандарттау комитеті қабылдаған қайта қарастырылған жіктеу жүйесінде Ib типті жағдайлар енді II типті ПЭ, Плейотроптық әсер деп аталады. I типтегі тапшылықтың көп бөлігі антитромбин геніндегі нүктелік мутациялар, жойылулар немесе шағын енулерден туындайды. Бұл генетикалық мутациялар әртүрлі механизмдер арқылы I типтегі тапшылыққа әкеледі: мутациялар биосинтез аяқталғаннан кейін дұрыс қанға шығарылмаған немесе қанда қысқа мерзімге ғана болатын тұрақсыз антитромбиндерді тудыруы мүмкін, мысалы, 106–108 кодондағы 6 негіз жұбының жойылуы. Мутация антитромбин генінің мРНК өңдеуіне әсер етуі мүмкін. Шағын енулер немесе жойылулар фрейм-шифт мутацияларына және антитромбин генінің ерте тоқтауына әкелуі мүмкін. Нүктелік мутациялар да тоқтату немесе аяқтау кодонының ертерек пайда болуына әкелуі мүмкін, мысалы, 129 кодонның CGA→TGA (транскрипциядан кейін UGA) мутациясы аргининнің қалыпты кодонын тоқтату кодонымен алмастырады.

ІІ типтегі антитромбин тапшылығы

ІІ типтегі антитромбин тапшылығы зардап шеккен адамдардың қанында антитромбин деңгейі қалыпты болғанымен, антитромбин активтілігі төмендеуімен сипатталады. Бастапқыда ІІ типтегі тапшылықты қай антитромбин функционалдық активтілігі төмендеген немесе сақталғандығына қарай үш кіші топқа (IIa, IIb және IIc) бөлу ұсынылған болатын.

Топонимдер

Қазіргі уақытта антитромбиннің нақты генетикалық мутациясын анықтау салыстырмалы түрде оңай. Бірақ, қазіргі заманғы сипаттау техникаларын пайдалануға дейін зерттеушілер мутацияларды ақаулықтан зардап шеккен адамның тұратын қаласының атымен атаған, яғни антитромбин мутациясы топоним ретінде белгіленген. Қазіргі заманғы мутациялық сипаттама көптеген жеке антитромбин топонимдерінің іс жүзінде бірдей генетикалық мутацияның нәтижесі екенін көрсетті, мысалы, антитромбин Тояма, антитромбин Кумамотоға, Амиенге, Турсқа, Париж 1-ге, Париж 2-ге, Алжирге, Падуа 2-ге және Барселонаға тең келеді. Немесе рекомбинанттық жолмен өндіріледі (мысалы, генетикалық өзгертілген ешкінің сүтінен өндірілген Atryn). Ол FDA-мен мұрагерлік антитромбин жетіспеушілігі бар пациенттерде операциядан немесе босанудан бұрын, кезінде немесе кейін қан ұюын алдын алу үшін антикоагулянт ретінде бекітілген.

Антиангиогендік антитромбин

Ангиогенез – бұрыннан бар қан тамырларынан жаңа қан тамырларының өсуін қамтитын физиологиялық процесс. Қалыпты физиологиялық жағдайларда ангиогенез қатаң түрде реттеледі және ангиогендік стимуляторлар мен ангиогендік ингибиторлардың тепе-теңдігімен бақыланады. Ісік өсуі ангиогенезге тәуелді, ал ісік даму кезінде ісік жасушалары шығаратын ангиогендік ингибиторлық факторлардың мөлшері төмендеуімен қатар, ангиогендік стимуляциялық факторлардың үздіксіз өндірілуі қажет. Антитромбиннің кесілген және жасырын түрі жануарлар моделінде ангиогенезді және ісік өсуін күшті түрде тежейді. Антитромбиннің прелатентті түрі in vitro жағдайында ангиогенезді тежейтіні көрсетілген, бірақ қазірге дейін жануарлар моделінде сынақтан өтпеген.