Антитромбин: структура, свойства и функции у человека.

Введение

Белки млекопитающих, обнаруженные у человека (Homo sapiens).

Антитромбин (AT) — это небольшой гликопротеин, который инактивирует несколько ферментов системы свертывания крови. Это белок, состоящий из 464 аминокислот, вырабатываемый печенью. Он содержит три дисульфидные связи и в общей сложности четыре потенциальных сайта гликозилирования. α-Антитромбин является основной формой антитромбина, обнаруженной в плазме крови, и имеет олигосахарид, занимающий каждый из четырех сайтов гликозилирования. В минорной форме антитромбина, β-антитромбине, один сайт гликозилирования остается постоянно незанятым. Его активность многократно возрастает под воздействием антикоагулянта гепарина, который усиливает связывание антитромбина с фактором IIa (тромбином) и фактором Xa.

Структура

Антитромбин также называется антитромбином III (АТ III). Обозначения антитромбина I – антитромбина IV возникли в ранних исследованиях, проведенных в 1950-х годах Сигерсом, Джонсоном и Феллом. Антитромбин I (АТ I) относится к связыванию тромбина с фибрином после активации тромбином фибриногена в некаталитическом центре связывания тромбина. Антитромбин II (АТ II) относится к кофактору в плазме, который вместе с гепарином препятствует взаимодействию тромбина и фибриногена. Антитромбин III (АТ III) относится к веществу в плазме, которое инактивирует тромбин. Антитромбин IV (АТ IV) относится к антитромбину, который активируется во время и вскоре после свертывания крови. Только АТ III и, возможно, АТ I имеют клиническое значение. АТ III обычно называют просто "антитромбином", и именно антитромбин III обсуждается в этой статье. Период полувыведения антитромбина в плазме крови составляет около 3 дней. Нормальная концентрация антитромбина в плазме крови человека высока – приблизительно 0,12 мг/мл, что эквивалентно молярной концентрации 2,3 мкМ. Антитромбин был выделен из плазмы большого числа видов, помимо человека. Как следует из секвенирования белков и кДНК, антитромбины коров, овец, кроликов и мышей состоят из 433 аминокислот, что на одну аминокислоту больше, чем человеческий антитромбин. Предполагается, что дополнительная аминокислота находится в позиции 6. Антитромбины коров, овец, кроликов, мышей и человека имеют 84–89% идентичности аминокислотной последовательности. Шесть аминокислот формируют три внутримолекулярные дисульфидные связи: Cys8–Cys128, Cys21–Cys95 и Cys248–Cys430. У всех из них есть четыре потенциальных сайта N-гликозилирования, расположенные в позициях аспарагина (Asn) 96, 135, 155 и 192 у человека и в аналогичных позициях у других видов. Все эти сайты заняты ковалентно присоединенными олигосахаридными боковыми цепями в преобладающей форме человеческого антитромбина, α-антитромбине, что приводит к молекулярной массе этой формы антитромбина 58 200. Рекомбинантные антитромбины со свойствами, сходными со свойствами нормального человеческого антитромбина, были получены с использованием клеток насекомых, инфицированных бакуловирусом, и клеточных линий млекопитающих, культивируемых в клеточной культуре. Эти рекомбинантные антитромбины обычно имеют отличные от нормального антитромбина паттерны гликозилирования и обычно используются в исследованиях структуры антитромбина. Поэтому многие структуры антитромбина, хранящиеся в базе данных белков и представленные в этой статье, демонстрируют вариабельные паттерны гликозилирования. Антитромбин начинает свое существование в нативном состоянии, которое обладает более высокой свободной энергией по сравнению с латентным состоянием, в которое он переходит в среднем через 3 дня. Латентное состояние имеет ту же конформацию, что и активированное состояние, то есть когда он ингибирует тромбин. Таким образом, это классический пример полезности кинетического и термодинамического контроля сворачивания белка.

Antithrombin is also termed antithrombin III (AT III). The designations antithrombin I through to antithrombin IV originate in early studies carried out in the 1950s by Seegers, Johnson and Fell. Antithrombin I (AT I) refers to the binding of thrombin to fibrin, after thrombin has activated fibrinogen, at a non catalytic binding site of thrombin. Antithrombin II (AT II) refers to a cofactor in plasma, which together with heparin interferes with the interaction of thrombin and fibrinogen. Antithrombin III (AT III) refers to a substance in plasma that inactivates thrombin. Antithrombin IV (AT IV) refers to an antithrombin that becomes activated during and shortly after blood coagulation. Only AT III and possibly AT I are medically significant. AT III is generally referred to solely as "antithrombin" and it is antithrombin III that is discussed in this article. Antithrombin has a half life in blood plasma of around 3 days. The normal antithrombin concentration in human blood plasma is high at approximately 0.12 mg/ml, which is equivalent to a molar concentration of 2.3 μM. Antithrombin has been isolated from the plasma of a large number of species additional to humans. As deduced from protein and cDNA sequencing, cow, sheep, rabbit and mouse antithrombins are all 433 amino acids in length, which is one amino acid longer than human antithrombin. The extra amino acid is thought to occur at amino acid position 6. Cow, sheep, rabbit, mouse, and human antithrombins share between 84 and 89% amino acid sequence identity. Six of the amino acids form three intramolecular disulfide bonds, Cys8 Cys128, Cys21 Cys95, and Cys248 Cys430. They all have four potential N glycosylation sites. These occur at asparagine (Asn) amino acid numbers 96, 135, 155, and 192 in humans and at similar amino acid numbers in other species. All these sites are occupied by covalently attached oligosaccharide side chains in the predominant form of human antithrombin, α antithrombin, resulting in a molecular weight for this form of antithrombin of 58,200. Recombinant antithrombins with properties similar to those of normal human antithrombin have been produced using baculovirus infected insect cells and mammalian cell lines grown in cell culture. These recombinant antithrombins generally have different glycosylation patterns to normal antithrombin and are typically used in antithrombin structural studies. For this reason many of the antithrombin structures stored in the protein data bank and presented in this article show variable glycosylation patterns. Antithrombin begins in its native state, which has a higher free energy compared to the latent state, which it decays to on average after 3 days. The latent state has the same form as the activated state that is, when it is inhibiting thrombin. As such it is a classic example of the utility of kinetic vs thermodynamic control of protein folding.

Функция

Антитромбин является серпином (ингибитором серинпротеазы) и, таким образом, по структуре схож с большинством других ингибиторов плазменных протеаз, таких как альфа-1 антихимотрипсин, альфа-2 антиплазмин и гепарин-кофактор II. Физиологическими мишенями антитромбина являются протеазы контактного пути активации (ранее известного как внутренний путь), а именно активированные формы фактора X (Xa), фактора IX (IXa), фактора XI (XIa), фактора XII (XIIa) и, в большей степени, фактора II (тромбина) (IIa), а также активированная форма фактора VII (VIIa) из пути тканевого фактора (ранее известного как внешний путь). Ингибитор также инактивирует калликреин и плазмин, также участвующие в свертывании крови. Однако он инактивирует и некоторые другие серинпротеазы, не участвующие в коагуляции, такие как трипсин и C1s-субъединицу фермента C1, участвующего в классическом пути комплемента. Инактивация протеазы происходит в результате захвата протеазы в эквимолярном комплексе с антитромбином, в котором активный центр фермента протеазы недоступен для его обычного субстрата. Однако связи P3-P4 и P1'-P2' могут быть быстро расщеплены нейтрофильной эластазой и бактериальным ферментом термолизином, что приводит к образованию неактивных антитромбинов, утративших способность ингибировать активность тромбина. Скорость ингибирования протеазной активности антитромбином значительно повышается при его дополнительном связывании с гепарином, а также при его инактивации нейтрофильной эластазой. Скорость инактивации тромбина антитромбином возрастает до 1,5–4 x 107 М−1 с−1 в присутствии гепарина, то есть реакция ускоряется в 2000–4000 раз. Ингибирование фактора Xa ускоряется лишь в 500–1000 раз в присутствии гепарина, а максимальная константа скорости в 10 раз ниже, чем при ингибировании тромбина. В одном из механизмов гепариновая стимуляция ингибирования факторов IXa и Xa зависит от конформационного изменения внутри антитромбина, затрагивающего петлю реактивного центра, и, таким образом, является аллостерической. В другом механизме стимуляция ингибирования тромбина зависит от образования третичного комплекса между AT III, тромбином и гепарином. В отсутствие гепарина аминокислоты P14 и P15 (см. рисунок 3) из петли реактивного центра встроены в основной корпус белка (в частности, верхнюю часть бета-листа A). Эта особенность характерна и для других серпинов, таких как гепарин-кофактор II, альфа-1 антихимотрипсин и MENT. Наиболее значимые конформационные изменения для ингибирования факторов IXa и Xa связаны с аминокислотами P14 и P15 в пределах N-концевой области петли реактивного центра (окруженные на рисунке 4, модель B). Эта область называется "шарниром". Конформационное изменение в области шарнира в ответ на связывание гепарина приводит к вытеснению P14 и P15 из основного тела белка, и было показано, что предотвращение этого изменения конформации не приводит к увеличению ингибирования факторов IXa и Xa. Считается, что это связано с необходимостью связывания антитромбина и тромбина с одной и той же цепью гепарина, расположенными рядом друг с другом. Это видно на серии моделей, представленных на рисунке 5. В структурах, показанных на рисунке 5, C-концевая часть (сторона P') петли реактивного центра имеет расширенную конформацию по сравнению с другими неактивированными или гепариноактивированными структурами антитромбина. Шарнирная область антитромбина в комплексе на рисунке 5 не могла быть смоделирована из-за ее конформационной гибкости, и аминокислоты P9-P14 не видны в этой структуре. Эта конформационная гибкость указывает на то, что в комплексе может существовать равновесие между конформацией антитромбина с вставленной петлей реактивного центра P14-P15 и конформацией с вытесненной петлей реактивного центра P14-P15. В подтверждение этого анализ расположения P15 Gly в комплексе на рисунке 5 (обозначенном в модели B) показывает, что он вставлен в бета-лист A (см. модель C). Разница в константе диссоциации между ними в три раза для пентасахарида, показанного на рисунке 3, и более чем в десять раз для гепарина полной длины, при этом β-антитромбин имеет более высокое сродство. Считается, что более высокая аффинность β-антитромбина обусловлена увеличенной скоростью последующих конформационных изменений в белке после первоначального связывания с гепарином. Для α-антитромбина дополнительное гликозилирование при Asn 135, вероятно, не влияет на начальное связывание гепарина, но скорее ингибирует любые последующие конформационные изменения.

Antithrombin is a serpin (serine protease inhibitor) and is thus similar in structure to most other plasma protease inhibitors, such as alpha 1 antichymotrypsin, alpha 2 antiplasmin and Heparin cofactor II. The physiological target proteases of antithrombin are those of the contact activation pathway (formerly known as the intrinsic pathway), namely the activated forms of Factor X (Xa), Factor IX (IXa), Factor XI (XIa), Factor XII (XIIa) and, to a greater extent, Factor II (thrombin) (IIa), and also the activated form of Factor VII (VIIa) from the tissue factor pathway (formerly known as the extrinsic pathway). The inhibitor also inactivates kallikrein and plasmin , also involved in blood coagulation. However it inactivates certain other serine proteases that are not involved in coagulation such as trypsin and the C1s subunit of the enzyme C1 involved in the classical complement pathway. Protease inactivation results as a consequence of trapping the protease in an equimolar complex with antithrombin in which the active site of the protease enzyme is inaccessible to its usual substrate. However, bonds P3 P4 and P1' P2' can be rapidly cleaved by neutrophil elastase and the bacterial enzyme thermolysin, respectively, resulting in inactive antithrombins no longer able to inhibit thrombin activity. The rate of antithrombin's inhibition of protease activity is greatly enhanced by its additional binding to heparin, as is its inactivation by neutrophil elastase. The rate of antithrombin thrombin inactivation increases to 1.5 4 x 107 M−1 s−1 in the presence of heparin, i. e. the reaction is accelerated 2000 4000 fold. Factor Xa inhibition is accelerated by only 500 to 1000 fold in the presence of heparin and the maximal rate constant is 10 fold lower than that of thrombin inhibition. In one mechanism heparin stimulation of Factor IXa and Xa inhibition depends on a conformational change within antithrombin involving the reactive site loop and is thus allosteric. In another mechanism stimulation of thrombin inhibition depends on the formation of a ternary complex between AT III, thrombin, and heparin. In the absence of heparin, amino acids P14 and P15 (see Figure 3) from the reactive site loop are embedded within the main body of the protein (specifically the top of beta sheet A). This feature is in common with other serpins such as heparin cofactor II, alpha 1 antichymotrypsin and MENT. The conformational change most relevant for Factor IXa and Xa inhibition involves the P14 and P15 amino acids within the N terminal region of the reactive site loop (circled in Figure 4 model B). This region has been termed the hinge region. The conformational change within the hinge region in response to heparin binding results in the expulsion of P14 and P15 from the main body of the protein and it has been shown that by preventing this conformational change, increased Factor IXa and Xa inhibition does not occur. This is thought to be due to a requirement that antithrombin and thrombin must bind to the same heparin chain adjacent to each other. This can be seen in the series of models shown in Figure 5. In the structures shown in Figure 5 the C terminal portion (P' side) of the reactive site loop is in an extended conformation when compared with other un activated or heparin activated antithrombin structures. The hinge region of antithrombin in the Figure 5 complex could not be modelled due to its conformational flexibility, and amino acids P9 P14 are not seen in this structure. This conformational flexibility indicates an equilibrium may exist within the complex between a P14 P15 reactive site loop inserted antithrombin conformation and a P14 P15 reactive site loop expelled conformation. In support of this, analysis of the positioning of P15 Gly in the Figure 5 complex (labelled in model B) shows it to be inserted into beta sheet A (see model C). The difference in dissociation constant between the two is threefold for the pentasaccharide shown in Figure 3 and greater than tenfold for full length heparin, with β antithrombin having a higher affinity. The higher affinity of β antithrombin is thought to be due to the increased rate at which subsequent conformational changes occur within the protein upon initial heparin binding. For α antithrombin, the additional glycosylation at Asn 135 is not thought to interfere with initial heparin binding, but rather to inhibit any resulting conformational changes.

Недостачи

Доказательства важной роли антитромбина в регуляции нормальной свертываемости крови демонстрируются взаимосвязью между наследственным или приобретенным дефицитом антитромбина и повышенным риском развития тромбоза у любого человека, страдающего этим дефицитом. Дефицит антитромбина обычно выявляется у пациентов, перенесших рецидивирующий венозный тромбоз и тромбоэмболию легочной артерии.

Приобретенный дефицит антитромбина

Приобретенный дефицит антитромбина развивается вследствие трех принципиально различных механизмов. Первый механизм – усиленная экскреция, которая может наблюдаться при почечной недостаточности, сопровождающейся протеинурией и нефротическим синдромом. Второй механизм связан со снижением продукции, что встречается при печеночной недостаточности или циррозе печени, либо при незрелости печени, вызванной преждевременными родами. Третий механизм обусловлен ускоренным потреблением, которое наиболее выражено при тяжелых травмах, но также может проявляться в меньшей степени в результате вмешательств, таких как обширные хирургические операции или искусственное кровообращение.

Наследственный дефицит антитромбина

Частота встречаемости наследственного дефицита антитромбина оценивается от 1 случая на 2000 до 1 случая на 5000 человек в общей популяции, а первая семья, страдающая наследственным дефицитом антитромбина, была описана в 1965 году. Впоследствии было предложено классифицировать наследственный дефицит антитромбина на тип I или тип II, основываясь на результатах функциональных и иммунохимических анализов антитромбина. Поддержание достаточного уровня антитромбиновой активности, составляющего не менее 70% от нормального функционального уровня, необходимо для эффективного ингибирования протеаз свертывания крови. Обычно, при дефиците антитромбина типа I или типа II, функциональные уровни антитромбина снижаются ниже 50% от нормы.

Дефицит антитромбина I типа

Антитромбиновый дефицит типа I характеризуется снижением как антитромбиновой активности, так и концентрации антитромбина в крови у пациентов. Дефицит типа I изначально был разделен на две подгруппы, Ia и Ib, на основании аффинности к гепарину. Антитромбин пациентов подгруппы Ia демонстрировал нормальную аффинность к гепарину, в то время как антитромбин пациентов подгруппы Ib – сниженную аффинность. Последующий функциональный анализ группы случаев 1b выявил не только сниженную аффинность к гепарину, но и множественные, или «плейотропные», аномалии, затрагивающие реактивный центр, участок связывания гепарина и концентрацию антитромбина в крови. В пересмотренной системе классификации, принятой Научным и стандартизационным комитетом Международного общества по тромбозам и гемостазу, случаи типа Ib теперь классифицируются как тип II ПЭ (плейотропный эффект). Большинство случаев дефицита типа I обусловлены точечными мутациями, делециями или небольшими вставками в гене антитромбина. Эти генетические мутации приводят к дефициту типа I посредством различных механизмов: мутации могут приводить к образованию нестабильных антитромбинов, которые либо неправильно экспортируются в кровь после завершения биосинтеза, либо имеют сокращенный период существования в крови, например, при делеции 6 пар оснований в кодонах 106–108. Мутации могут влиять на процессинг мРНК гена антитромбина. Незначительные вставки или делеции могут вызывать сдвиг рамки считывания и преждевременную терминацию трансляции гена антитромбина. Точечные мутации также могут приводить к преждевременному образованию стоп-кодона, например, мутация кодона 129, CGA→TGA (UGA после транскрипции), заменяет нормальный кодон для аргинина на стоп-кодон.

Дефицит антитромбина II типа

Антитромбиновый дефицит II типа характеризуется нормальным уровнем антитромбина, но сниженной активностью антитромбина в крови у пациентов. Изначально было предложено разделить дефицит II типа на три подгруппы (IIa, IIb и IIc) в зависимости от того, какая функциональная активность антитромбина снижена или сохранена.

Топонимы

В настоящее время относительно легко охарактеризовать конкретную генетическую мутацию антитромбина. Однако до появления современных методов определения мутаций исследователи называли мутации в честь города или местности, где проживал пациент с дефицитом, то есть мутация антитромбина получала название по географическому признаку (топоним). Современный анализ мутаций показал, что многие отдельные топонимы антитромбина на самом деле являются результатом одной и той же генетической мутации; например, антитромбин Тояма эквивалентен антитромбину Кумамото, Амиен, Тур, Париж 1, Париж 2, Алжир, Падуа 2 и Барселона. Также антитромбин может быть получен рекомбинантным путем (например, Atryn, который производится в молоке генетически модифицированных коз). Он одобрен FDA в качестве антикоагулянта для профилактики образования тромбов до, во время или после хирургических операций или родов у пациентов с наследственным дефицитом антитромбина.

Антиангиогенный антитромбин

Ангиогенез – это физиологический процесс, включающий образование новых кровеносных сосудов из уже существующих. В нормальных физиологических условиях ангиогенез строго регулируется и контролируется балансом ангиогенных стимуляторов и ангиогенных ингибиторов. Рост опухоли зависит от ангиогенеза, и в процессе развития опухоли требуется устойчивое производство ангиогенных стимулирующих факторов, а также снижение количества ангиогенных ингибирующих факторов, продуцируемых опухолевыми клетками. Расщепленная и латентная форма антитромбина мощно ингибирует ангиогенез и рост опухоли в моделях на животных. Показано, что прелатентная форма антитромбина ингибирует ангиогенез in vitro, однако на данный момент она не была протестирована на экспериментальных животных.