Иммунопероксидаза: клеткалық құрамының анықталуы мен зерттелуі
Immunoperoxidase
Иммунопероксидаза – молекулярлық биологияда қолданылатын иммунохимиялық әдіс. Антиденелер арқылы протеиндерді анықтау, зертханалық диагностика үшін маңызды.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Иммунопероксидаза – молекулалық биологияда, медициналық зерттеулерде және клиникалық диагностикада қолданылатын иммунобояудың бір түрі. Иммунопероксидазалық реакциялар – антиденелер пероксидаза катализдейтін реакция арқылы көрінетін иммуногистохимиялық немесе иммуноцитохимиялық процедуралардың бір тармағы. Иммуногистохимия және иммуноцитохимия – нақты белгілі бір белок немесе басқа да макромолекулалардың қай жасушаларда немесе жасушалардың бөліктерінде орналасқанын анықтауға арналған әдістер. Бұл бояулар антиденелерді пайдаланады, олар әдетте ақуыз немесе гликопротеин болып табылатын нақты антигендерге байланысады. Антиденелер көзбен көрінбейтіндіктен, байланысқан антиденелерді анықтау үшін арнайы тәсілдер қолдану қажет. Иммунопероксидазалық процедурада пероксидаза деп аталатын фермент түсті өнім алу үшін химиялық реакцияны катализдейді. Яғни, өте жұқа тіндің кесігі шыныға бекітіліп, антидене немесе антиденелер тізбегімен инкубацияланады, соңғысы химиялық түрде пероксидазаға байланысқан болады. Химиялық субстрат қосылып, бояу дамығаннан кейін, бояудың таралуын микроскоп арқылы қарап тексеруге болады.
Immunoperoxidase is a type of immunostain used in molecular biology, medical research, and clinical diagnostics. In particular, immunoperoxidase reactions refer to a sub class of immunohistochemical or immunocytochemical procedures in which the antibodies are visualized via a peroxidase catalyzed reaction. Immunohistochemistry and immunocytochemistry are methods used to determine in which cells or parts of cells a particular protein or other macromolecule are located. These stains use antibodies to bind to specific antigens, usually of protein or glycoprotein origin. Since antibodies are normally invisible, special strategies must be employed to detect these bound antibodies. In an immunoperoxidase procedure, an enzyme known as a peroxidase is used to catalyze a chemical reaction to produce a coloured product. Simply, a very thin slice of tissue is fixed onto glass, incubated with antibody or a series of antibodies, the last of which is chemically linked to peroxidase. After developing the stain by adding the chemical substrate, the distribution of the stain can be examined by microscopy.
Антителолардың түрлері
Бастапқыда иммунобояу үшін жасалған барлық антиденелер поликлоналды болды, яғни жылқылар мен қояндар сияқты жануарлардағы қалыпты антидене реакциялары арқылы алынған. Қазіргі кезде көптеген антиденелер моноклоналды, яғни тіндер мәдениетінде өндіріледі. Бір типті антиденеден ғана тұратын моноклоналды антиденелер антигенге қатысты жоғары ерекшелікке ие болады және партиялар арасында тұрақты нәтижелер береді.
Originally all antibodies produced for immunostaining were polyclonal, i. e. raised by normal antibody reactions in animals such as horses or rabbits. Now, many are monoclonal, i. e. produced in tissue culture. Monoclonal antibodies that consist of only one type of antibody tend to provide greater antigen specificity, and also tend to be more consistent between batches.
Иммунопероксидазалық бояу әдістері
Иммунопероксидазалық бояудың алғашқы қадамы – спецификалық (бірінші) антителоның жасуша немесе тіндік үлгіге байланысуы. Негізгі антителоны тікелей (1-мысал) немесе жанама (2- және 3-мысалдар) жолмен анықтауға болады. 1-мысал. Бастапқы антителоға тікелей пероксидаза ферментімен таңба қойылып, одан кейін түсті өнім алу үшін химиялық реакцияны катализдеуге қолданылады. 2-мысал. Бастапқы антитело жоғары туыстығы бар, пероксидазамен конъюгацияланған байланысу молекуласымен танылатын кішкентай молекуламен таңбаланады. Бұған ең көп кездесетін мысал – биотинмен байланысқан, ферментке байланысқан стрептавидинмен байланысатын негізгі антитело. Бұл әдіс сигналды күшейту үшін қолданылуы мүмкін. 3-мысал. Таңбаланбаған негізгі антитело, негізгі антителомен бірдей жануар түрінен шыққан барлық антителоларды танитын жалпы екіншілік антитело арқылы анықталады. Екіншілік антитело пероксидазамен таңбаланады. Оптималды бояу антителоның еңімі, бояуға қолданылатын химиялық заттар, жасушалардың/тіндердің дайындалуы және/немесе бекітілуі, сондай-ақ антителомен/бояу реагенттерімен инкубациялау ұзақтығы сияқты бірқатар факторларға байланысты. Мұндай жағдайларда, жүйелі тәсілдің орнына сынақ-қателік әдісі қолданылады.
The first step in immunoperoxidase staining is the binding of the specific (primary) antibody to the cell or tissue sample. The detection of the primary antibody can be then accomplished directly (example 1) or indirectly (examples 2 & 3). Example 1. The primary antibody can be directly tagged with the enzyme peroxidase which is then used to catalyse a chemical reaction to generate a coloured product. Example 2. The primary antibody can be tagged with a small molecule that can be recognised by a peroxidase conjugated binding molecule with high affinity. The most common example of this is a biotin linked primary antibody that binds to an enzyme bound streptavidin. This method can be used to amplify the signal. Example 3. An untagged primary antibody is detected using a general secondary antibody that recognises all antibodies originating from same animal species as the primary. The secondary antibody is tagged with peroxidase. Optimal staining depends on a number of factors including the antibody dilution, the staining chemicals, the preparation and/or fixation of the cells/tissue, and length of incubation with antibody/staining reagents. These are often determined by trial and error rather than any sort of systematic approach.
Пероксидазалық бояуларға балама
Басқа да каталитикалық ферменттер, мысалы, сілтілік фосфатаза, тікелей және жанама бояу әдістерінде пероксидазалардың орнына қолданылуы мүмкін. Балама ретінде, негізгі антителоны флуоресценттік маркермен (иммунофлуоресценция) анықтауға немесе электронды микроскопия үшін коллоидты алтын бөлшектерімен байланыстыруға болады.
Other catalytic enzymes such as alkaline phosphatase can be used instead of peroxidases for both direct and indirect staining methods. Alternatively, the primary antibody can be detected using fluorescent label (immunofluorescence), or be attached to colloidal gold particles for electron microscopy.
Иммунопероксидазалық бояудың қолданылуы
Иммунопероксидазалық бояу клиникалық диагностикада және зертханалық зерттеулерде қолданылады. Клиникалық диагностикада иммунобояу тіндік биопсияларда егжей-тегжейлі гистопатологиялық зерттеу үшін пайдаланылуы мүмкін. Қатерлі ісіктерде ол ісіктерді кіші топтарға жіктеуге көмектеседі. Иммунобояу тері ауруларын, гломерулонефритті диагностикалауға және амилоидты жинақтарды жіктеуге де көмектесе алады. Бұған ұқсас техникалар лимфоциттердің түрлерін анықтау үшін де пайдалы, себебі олар жарық микроскопиясында өте ұқсас көрінеді. Зертханалық зерттеулерде жасушалық дифференциацияның нақты маркерлеріне қарсы антиденелер жеке жасуша түрлерін белгілеу үшін қолданылады. Бұл белгілі бір эксперименттік әрекеттің нәтижесінде нақты жасушалық желілердегі механикалық өзгерістерді жақсырақ түсінуге мүмкіндік береді.
Immunoperoxidase staining is used in clinical diagnostics and in laboratory research. In clinical diagnostics, immunostaining can be used on tissue biopsies for more detailed histopathological study. In the case of cancer, it can aid in sub classifying tumours. Immunostaining can also be used to help diagnose skin conditions, glomerulonephritis and to sub classify amyloid deposits. Related techniques are also useful in sub typing lymphocytes which all look quite similar on light microscopy. In laboratory research, antibodies against specific markers of cellular differentiation can be used to label individual cell types. This can enable a better understanding of mechanistic changes to specific cell lineages resulting from a particular experimental intervention.