Антивдене және ферментті пайдалану арқылы антигенді анықтау әдісі

Кіріспе

Антигенді антидене мен фермент арқылы анықтау әдісі. Энзимге байланысты иммуносорбенттік талдау (ELISA) (/ˈiː.laɪ.zə/) – алғаш рет 1971 жылы Ева Энгвалл мен Питер Перлман сипаттаған, көп қолданылатын аналитикалық биохимиялық талдау. Бұл талдау – сұйық үлгідегі лигандтың (көбінесе ақуыздың) болуын анықтау үшін, оған қарсы бағытталған антиденелерді пайдаланатын ферменттік иммуноанализдің (EIA) қатты фазалық түрі. ELISA медицинада, өсімдік патологиясында және биотехнологияда диагностикалық құрал ретінде, сондай-ақ түрлі салаларда сапаны бақылау үшін қолданылады. ELISA-ның ең қарапайым түрінде сынамадағы антигендер бетке бекітіледі. Содан кейін антигенмен байланысу үшін оған сәйкес антиденелер қосылады. Бұл антидене ферментке байланысқаннан кейін, байланыспаған антиденелер алынып тасталады. Соңғы қадамда фермент субстратын қамтитын зат қосылады. Егер байланыс болса, одан кейін болатын реакция анықталатын сигналды – көбінесе түс өзгерісін – тудырады. ELISA-ны жүргізу үшін белгілі бір антигенге ерекшелік танытатын кем дегенде бір антидене қажет. Белгісіз мөлшердегі антигені бар сынама қатты тірекке (әдетте полистирол микротитрлық пластинаға) адсорбция арқылы ерекшеліксіз немесе басқа антидене арқылы ерекшелікпен ("сэндвич" ELISA) бекітіледі. Антиген бекітілгеннен кейін анықтау антиденесі қосылады, ол антигенмен кешен құрайды. Анықтау антиденесі ферментпен ковалентті байланыста болуы мүмкін немесе биоконъюгация арқылы ферментке байланысқан екіншілік антидене арқылы анықталуы мүмкін. Әр қадам арасында тақта арнайы емес байланысқан ақуыздар мен антиденелерді жою үшін жұмсақ жуғыш ерітіндімен жуылады. Соңғы жуудан кейін тақта ферменттік субстрат қосылып, сынамадағы антиген мөлшерін көрсететін көрінетін сигналды тудыру арқылы дайындалады. Қызықтысы, ELISA қатаң түрде "иммуно" талдаулардың орнына лигандты байланыстыру талдауларының басқа түрлерін де жүзеге асыруы мүмкін, бірақ бұл әдістің кеңінен қолданылуы мен даму тарихына байланысты атауы бастапқы "иммуно" атауын сақтап қалды. Бұл техника негізінен қатты фазада бекітілген кез келген лигациялық реагентті және нақты байланысатын және ферменттерді дұрыс өлшенетін сигналды тудыру үшін қолданатын анықтау реагентін қажет етеді. Жуулар арасында тек лиганд және оның ерекше байланысқан серіктестері ғана антиген-антидене өзара әрекеттесуі арқылы қатты фазаға ерекше байланысады немесе "иммуносорбцияланады", ал ерекше емес немесе байланыспаған компоненттер жуылып кетеді. Басқа спектрофотометриялық зертханалық талдау форматтарынан айырмашылығы, онда жуылғаннан кейін сол реакциялық ұңғыманы (мысалы, куветканы) қайта пайдалануға болады, ELISA пластиналары реакция өнімдерін пластинаның бір бөлігі болып табылатын қатты фазада иммуносорбциялайды, сондықтан оларды қайта пайдалану қиын.

Method to detect an antigen using an antibody and enzyme

The enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) (/ᵻ/'/l//aɪ//z//ə/, ,/iː/'/l//aɪ//z//ə/) is a commonly used analytical biochemistry assay, first described by Eva Engvall and Peter Perlmann in 1971. The assay is a solid phase type of enzyme immunoassay (EIA) to detect the presence of a ligand (commonly a protein) in a liquid sample using antibodies directed against the ligand to be measured. ELISA has been used as a diagnostic tool in medicine, plant pathology, and biotechnology, as well as a quality control check in various industries. In the most simple form of an ELISA, antigens from the sample to be tested are attached to a surface. Then, a matching antibody is applied over the surface so it can bind the antigen. This antibody is linked to an enzyme and then any unbound antibodies are removed. In the final step, a substance containing the enzyme's substrate is added. If there was binding, the subsequent reaction produces a detectable signal, most commonly a color change. Performing an ELISA involves at least one antibody with specificity for a particular antigen. The sample with an unknown amount of antigen is immobilized on a solid support (usually a polystyrene microtiter plate) either non specifically (via adsorption to the surface) or specifically (via capture by another antibody specific to the same antigen, in a "sandwich" ELISA). After the antigen is immobilized, the detection antibody is added, forming a complex with the antigen. The detection antibody can be covalently linked to an enzyme or can itself be detected by a secondary antibody that is linked to an enzyme through bioconjugation. Between each step, the plate is typically washed with a mild detergent solution to remove any proteins or antibodies that are non specifically bound. After the final wash step, the plate is developed by adding an enzymatic substrate to produce a visible signal, which indicates the quantity of antigen in the sample. Of note, ELISA can perform other forms of ligand binding assays instead of strictly "immuno" assays, though the name carried the original "immuno" because of the common use and history of development of this method. The technique essentially requires any ligating reagent that can be immobilized on the solid phase along with a detection reagent that will bind specifically and use an enzyme to generate a signal that can be properly quantified. In between the washes, only the ligand and its specific binding counterparts remain specifically bound or "immunosorbed" by antigen antibody interactions to the solid phase, while the nonspecific or unbound components are washed away. Unlike other spectrophotometric wet lab assay formats where the same reaction well (e. g., a cuvette) can be reused after washing, the ELISA plates have the reaction products immunosorbed on the solid phase, which is part of the plate, and so are not easily reusable.

Принцип

Аналитикалық биохимиялық талдау және "сулы зертхана" әдісі ретінде ELISA, сұйық үлгідегі аналит (яғни, саны немесе сапасы бойынша талданатын нақты зат) анықтауды қамтиды, бұл үшін талдау кезінде сұйық реагенттерді пайдалану жалғастырылады (яғни, биохимиялық реакциялардың бақыланатын тізбегі, нәтижесінде оңай өлшенетін және үлгідегі аналиттің мөлшерінің көрсеткіші ретінде интерпретацияланатын сигнал пайда болады). Бұл реакция сұйық күйде қалады және реакциялық камерада немесе реактивтерді ұстауға қажетті ұңғымада орналасады. Бұл "құрғақ зертхана" әдістерінен өзгеше, онда құрғақ жолақтар қолданылады. Егер үлгі сұйық болса да (мысалы, өлшенген шағын тамшы), "құрғақ" талдаудың соңғы анықтау кезеңі құрғақ жолақты рефлектометрия сияқты әдістермен оқуды қамтиды және сынамалардың араласуын немесе төгілуін болдырмау үшін реакцияны ұстау камерасы қажет емес. Гетерогенді талдау ретінде ELISA, талдау реакциясы қоспасының кейбір компоненттерін физикалық түрде қозғалмайтын қатты фазаға адсорбциялау арқылы бөліп алады. ELISA-да, сұйық үлгі арнайы байланыстыру қасиеттері бар тұрақты қатты фазаға қосылады, содан кейін бірнеше сұйық реагенттер тізбектеп қосылады, инкубацияланады және жуылады. Соңында, ұңғымадағы соңғы сұйықтықта оптикалық өзгерістер (мысалы, ферменттік реакцияның өнімінен түс пайда болуы) байқалады, одан аналиттің мөлшері өлшенеді. Сандық "оқу" әдетте спектрофотометрия арқылы берілетін жарықтың интенсивтілігін анықтауға негізделеді, бұл сұйық арқылы (сондай-ақ, көп ұңғымалық тақта форматындағы ұңғыманың мөлдір түбінен) белгілі бір толқын ұзындығындағы жарықтың өтуін өлшеуді қамтиды. Аналит лиганд деп те аталады, өйткені ол анықтау реагентімен ерекше байланысады немесе лигандаланады, сондықтан ELISA лигандты байланыстыру талдауларының кең санатына жатады. (Бұл жердегі "қатты фаза" / "қатты субстрат" жуылып кетілетін қатты микробөлшектер / дөңгелектерге қарама-қарсы), ол әдетте "ELISA тақтасы" деп аталатын көп ұңғымалық тақта ретінде құрастырылады. Әдетте, басқа иммуноталдау түрлері сияқты, антиген-антидене реакциясының ерекшелігі қолданылады, өйткені антигенге қарсы антиденелерді реактив ретінде көп мөлшерде өндіру оңай. Егер аналит өзі антидене болса, оның мақсатты антигенін байланыстыру реагенті ретінде пайдалануға болады.

As an analytical biochemistry assay and a "wet lab" technique, ELISA involves detection of an analyte (i. e., the specific substance whose presence is being quantitatively or qualitatively analyzed) in a liquid sample by a method that continues to use liquid reagents during the analysis (i. e., controlled sequence of biochemical reactions that will generate a signal which can be easily quantified and interpreted as a measure of the amount of analyte in the sample) that stays liquid and remains inside a reaction chamber or well needed to keep the reactants contained. This is in contrast to "dry lab" techniques that use dry strips. Even if the sample is liquid (e. g., a measured small drop), the final detection step in "dry" analysis involves reading of a dried strip by methods such as reflectometry and does not need a reaction containment chamber to prevent spillover or mixing between samples. As a heterogenous assay, ELISA separates some component of the analytical reaction mixture by adsorbing certain components onto a solid phase which is physically immobilized. In ELISA, a liquid sample is added onto a stationary solid phase with special binding properties and is followed by multiple liquid reagents that are sequentially added, incubated, and washed, followed by some optical change (e. g., color development by the product of an enzymatic reaction) in the final liquid in the well from which the quantity of the analyte is measured. The quantitative "reading" is usually based on detection of intensity of transmitted light by spectrophotometry, which involves quantitation of transmission of some specific wavelength of light through the liquid (as well as the transparent bottom of the well in the multiple well plate format). The analyte is also called the ligand because it will specifically bind or ligate to a detection reagent, thus ELISA falls under the bigger category of ligand binding assays. (the stationary "solid phase"/"solid substrate" here as opposed to solid microparticle/beads that can be washed away), which is usually constructed as a multiple well plate known as the "ELISA plate". Conventionally, like other forms of immunoassays, the specificity of antigen antibody type reaction is used because it is easy to raise an antibody specifically against an antigen in bulk as a reagent. Alternatively, if the analyte itself is an antibody, its target antigen can be used as the binding reagent.

Тарих

ELISA әзірленгенге дейін иммуноталдау жүргізудің жалғыз мүмкіндігі радиоиммуноталдау болатын, бұл радиоактивті белгіленген антигендер немесе антителолар қолданылатын әдіс. Радиоиммуноталдауда радиоактивтілік сигналды қамтамасыз етеді, ол үлгіде белгілі бір антигеннің немесе антителоның бар-жоғын көрсетеді. Радиоиммуноталдау алғаш рет 1960 жылы Розалин Суссман Ялоу және Соломон Берсонның ғылыми мақаласында сипатталған. Радиоактивтілік денсаулыққа қауіп төндіретіндіктен, қауіпсіз балама іздестірілді. Радиоиммуноталдаудың қолайлы баламасы радиоактивті сигналдың орнына радиоактивті емес сигналды қолдану болар еді. Ферменттер (мысалы, аққұмық пероксидазасы) тиісті субстраттармен (мысалы, ABTS немесе TMB) реакцияға түскенде түстің өзгеруі пайда болады, ол сигнал ретінде қолданылады. Дегенмен, сигнал антителоның немесе антигеннің болуымен байланысты болуы керек, сондықтан фермент тиісті антителомен байланыстырылуы керек. Бұл байланыстыру процесін Stratis Avrameas және G. B. Пирс тәуелсіз түрде әзірледі. Байланыспаған антитело немесе антигенді жуу арқылы жою қажет болғандықтан, антитело немесе антиген контейнердің бетіне бекітілуі керек; яғни, иммуносорбент дайындалуы тиіс. Бұған қол жеткізу әдісін Wide және Jerker Porath 1966 жылы жариялады. 1971 жылы Швециядағы Стокгольм университетінің Петер Перлман және Ева Энгвалл, Нидерландыдағы Антон Шуурс және Бауке ван Веймен осы білімді EIA/ELISA жүргізу әдістеріне біріктіретін мақалаларын тәуелсіз түрде жариялады. Традициялық ELISA көбінесе хромогендік репортерлер мен субстраттарды қолданады, олар антигеннің немесе аналиттың болуын көрсететін байқалатын түс өзгерісін тудырады. Жаңа ELISA сияқты техникалар сандық сигналдар жасау үшін флюорогендік, электрохимилюминесценттік және сандық ПТР репортерлерін пайдаланады. Бұл жаңа репортерлердің жоғары сезімталдық және мультиплекстеу сияқты әртүрлі артықшылықтары болуы мүмкін. Техникалық тұрғыдан алғанда, осы типтегі жаңа талдаулар қатаң түрде ELISA болып табылмайды, өйткені олар «ферментке байланысты» емес, керісінше, ферментсіз репортерге байланысты. Алайда, бұл талдаулардың жалпы принциптері көбінесе ұқсас болғандықтан, олар көбінесе ELISA сияқты бір категорияға жатқызылады. 2012 жылы хромогендік репортер ретінде нанобөлшектерді қолданатын, фермент негізіндегі ультра сезімтал ELISA сынағы аналиттің аттограммаларын анықтау арқылы көзге көрінетін түс сигналын беруге қабілетті болды. Оң нәтижелер үшін көк түс, ал теріс нәтижелер үшін қызыл түс пайда болады. Бұл анықтама тек аналиттің бар-жоғын ғана растай алады, нақты концентрацияны емес.

Before the development of the ELISA, the only option for conducting an immunoassay was radioimmunoassay, a technique using radioactively labeled antigens or antibodies. In radioimmunoassay, the radioactivity provides the signal, which indicates whether a specific antigen or antibody is present in the sample. Radioimmunoassay was first described in a scientific paper by Rosalyn Sussman Yalow and Solomon Berson published in 1960. As radioactivity poses a potential health threat, a safer alternative was sought. A suitable alternative to radioimmunoassay would substitute a nonradioactive signal in place of the radioactive signal. When enzymes (such as horseradish peroxidase) react with appropriate substrates (such as ABTS or TMB), a change in color occurs, which is used as a signal. However, the signal has to be associated with the presence of antibody or antigen, which is why the enzyme has to be linked to an appropriate antibody. This linking process was independently developed by Stratis Avrameas and G. B. Pierce. Since it is necessary to remove any unbound antibody or antigen by washing, the antibody or antigen has to be fixed to the surface of the container; i. e., the immunosorbent must be prepared. A technique to accomplish this was published by Wide and Jerker Porath in 1966. In 1971, Peter Perlmann and Eva Engvall at Stockholm University in Sweden, and Anton Schuurs and Bauke van Weemen in the Netherlands independently published papers that synthesized this knowledge into methods to perform EIA/ELISA. Traditional ELISA typically involves chromogenic reporters and substrates that produce some kind of observable color change to indicate the presence of antigen or analyte. Newer ELISA like techniques use fluorogenic, electrochemiluminescent, and quantitative PCR reporters to create quantifiable signals. These new reporters can have various advantages, including higher sensitivities and multiplexing. In technical terms, newer assays of this type are not strictly ELISAs, as they are not "enzyme linked", but are instead linked to some nonenzymatic reporter. However, given that the general principles in these assays are largely similar, they are often grouped in the same category as ELISAs. In 2012, an ultrasensitive, enzyme based ELISA test using nanoparticles as a chromogenic reporter was able to give a naked eye colour signal, from the detection of mere attograms of analyte. A blue color appears for positive results and red color for negative. Note that this detection only can confirm the presence or the absence of analyte, not the actual concentration.

Түрлері

Көптеген ELISA тестілері белгілі бір молекулаларға арналған, олар сәйкес келетін антиденелерді пайдаланады. ELISA тестілері аналиттер мен антиденелердің байланысу және қолданылу әдісіне қарай бірнеше түрге бөлінеді. Негізгі түрлері төменде сипатталған.

Сэндвич

"Сэндвич" ELISA антигенді анықтау үшін қолданылады. Қадамдар: бет белгілі бір мөлшердегі тұтқындау антиденесімен дайындалады. Беттегі кез келген ерекше емес байланысу орындары бұғатталады. Антигені бар үлгі пластинаға салынып, антиденемен тұтылады. Байланбаған антигенді жою үшін пластина жуылады. Антигенге байланысатын антидене қосылады (содан "сэндвич" атауы: антиген екі антидене арасында бекітіледі). Бұл біріншілік антидене донордың сарысуында болуы мүмкін, антигенге реакциясын тексеру үшін сынақтан өтеді. Ферментке байланысты екіншілік антиденелер анықтау антиденелері ретінде қолданылады, олар антидененің Fc аймағына (ерекше емес) ерекше байланысады. Байланбаған антидене-фермент конъюгаттарын жою үшін пластина жуылады. Ферменттің түске, флуоресценттік немесе электрохимиялық сигналға айналдыруы үшін химиялық зат қосылады. Пластина ұңғымаларының сіңіру қабілеті, флуоресценциясы немесе электрохимиялық сигналы (мысалы, ток) антигеннің бар-жоғын және мөлшерін анықтау үшін өлшенеді. Оң жақтағы сурет ферментке конъюгацияланған екіншілік антидененің қолданылуын көрсетеді, бірақ техникалық тұрғыдан алғанда, егер біріншілік антидене ферментке конъюгацияланған болса, бұл қажет емес (бұл тікелей ELISA). Дегенмен, екіншілік антидене конъюгатын қолдану, кез келген антигенді анықтау үшін ферментке байланысқан антиденелерді жасаудың қымбат процесінен сақтайды. Басқа антиденелердің Fc аймағына байланысатын ферментке байланысқан антиденені пайдалану арқылы осы бір ферментке байланысқан антиденені әртүрлі жағдайларда қолдануға болады. "Тұтқындау" антиденесінің бірінші қабаты болмаса, үлгідегі кез келген белоктар (сарысу белоктарын қоса алғанда) пластина бетіне бәсекелестікпен сіңірілуі мүмкін, бұл бекітілген антиген мөлшерін азайтады. Антигенді пластикке бекіту үшін тазартылған спецификалық антиденені қолдану, өлшеуден бұрын антигенді күрделі қоспалардан тазарту қажеттілігін жояды, анализді жеңілдетеді және анализдің ерекшелігі мен сезімталдығын арттырады. Сондықтан зерттеу үшін қолданылатын "сэндвич" ELISA жиі жалған оң нәтижелер қаупін азайту үшін растауды қажет етеді.

A "sandwich" ELISA is used to detect sample antigen. The steps are:

A surface is prepared with a known quantity of capture antibody. Any nonspecific binding sites on the surface are blocked. The antigen containing sample is applied to the plate, and captured by antibody. The plate is washed to remove unbound antigen. A specific antibody is added, and binds to antigen (hence the 'sandwich': the antigen is stuck between two antibodies). This primary antibody could be in the serum of a donor, to be tested for reactivity towards the antigen. Enzyme linked secondary antibodies are applied as detection antibodies, which bind specifically to the antibody's Fc region (nonspecific). The plate is washed to remove the unbound antibody enzyme conjugates. A chemical is added to be converted by the enzyme into a color, fluorescent, or electrochemical signal. The absorbance, fluorescence, or electrochemical signal (e. g., current) of the plate's wells is measured to determine the presence and quantity of the antigen. The image to the right includes the use of a secondary antibody conjugated to an enzyme, although, in the technical sense, this is not necessary if the primary antibody is conjugated to an enzyme (which would be direct ELISA). However, the use of a secondary antibody conjugate avoids the expensive process of creating enzyme linked antibodies for every antigen one might want to detect. By using an enzyme linked antibody that binds the Fc region of other antibodies, this same enzyme linked antibody can be used in a variety of situations. Without the first layer of "capture" antibody, any proteins in the sample (including serum proteins) may competitively adsorb to the plate surface, lowering the quantity of antigen immobilized. Use of the purified specific antibody to attach the antigen to the plastic eliminates a need to purify the antigen from complicated mixtures before the measurement, simplifying the assay, and increasing the specificity and the sensitivity of the assay. Therefore, a sandwich ELISA used for research often needs validation, to reduce the risk of false positive results.

Бәсекеге қабілетті

ELISA-ның үшінші түрі – бәсекелестік байланысу. Осы ELISA-ның қадамдары алғашқы екі мысалдан шамалы өзгеше: белгісіз антидене оның антигенімен (үлгісімен) бірге инкубацияланады. Бұл байланысқан антидене/антиген кешендері антигенмен қапталған ұңғымаға қосылады. Тақта жуылғаннан кейін, байланыспаған антиденелер алынып тасталады. (Үлгідегі антигеннің мөлшері неғұрлым көп болса, Ag Ab кешендері соғұрлым көп түзіледі, демек, ұңғымадағы антигенге байланысу үшін байланыспаған антиденелердің саны азаяды, сондықтан «бәсекелестік» болады.) Біріншілік антиденеге тән екіншілік антидене қосылады. Бұл екінші антидене ферментпен байланыстырылған. Субстрат қосылады, ал қалған ферменттер хромогенді немесе флуоресцентті сигнал тудырады. Сигналдың толыққанды қанағаттануын болдырмау үшін реакция тоқтатылады. Кейбір бәсекелестік ELISA жиынтықтары ферментпен байланысты антиденелерге қарағанда ферментпен байланысты антигендерді қамтиды. Белгіленген антиген үлгі антигенімен (белгісіз) біріншілік антидене байланысу орындары үшін бәсекелеседі. Үлгідегі антигеннің мөлшері неғұрлым аз болса, белгіленген антиген ұңғымада соғұрлым көп сақталады және сигнал соғұрлым күшті болады. Көбінесе антиген алдымен ұңғымаға орналастырылмайды. АИТВ антиденелерін анықтау үшін микротитрлік пластинканың ұңғымалары АИТВ антигенімен қапталады. Екі спецификалық антидене қолданылады, біреуі ферментпен конъюгацияланған, ал екіншісі сарысуда болады (егер сарысуда антиденеге оң нәтиже болса). Екі антидененің бір антигенге қарсы жиынтық бәсекелестігі күшті сигналдың пайда болуына себеп болады. Тестілеуге жататын сарысулар осы ұңғымаларға қосылады, 37 °C температурада инкубацияланады, содан кейін жуылады. Егер антиденелер болса, антиген-антидене реакциясы жүзеге асады. Ферментпен белгіленген АИТВ антиденелеріне антиген қалмайды. Бұл антиденелер қосылғаннан кейін бос күйде қалады және жуу кезінде жуылып кетеді. Субстрат қосылады, бірақ оған әсер ететін фермент жоқ, сондықтан оң нәтиже түстің өзгеруін көрсетпейді.