β-галактозидаза ферменті: лактозаны, гликопротеиндерді және басқа β-D галактозидтерді ыдыратуға қатысады. Биологиялық маңызы зор, зерттеулерге арналған.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Гликозид гидролаза ферменттерінің отбасы
Family of glycoside hydrolase enzymes
β-галактозидаза (EC 3.2.1.23, лактаза, бета-галь немесе β-галь; жүйелі атауы β-D-галактозид галактогидролазы) – β-D-галактозидтердегі терминалды, тотыққан емес β-D-галактоза қалдықтарының гидролизін катализдейтін гликозид гидролаза ферменті. β-галактозидтерге галактоза бар, гликозидтік байланысы галактоза молекуласының үстінде орналасқан көмірсулар жатады. Әртүрлі β-галактозидазалардың субстраттарына ганглиозид GM1, лактозилцерамидтер, лактоза және әр түрлі гликопротеиндер кіреді.
β Galactosidase (EC 3.2.1.23, lactase, beta gal or β gal; systematic name β D galactoside galactohydrolase) is a glycoside hydrolase enzyme that catalyzes hydrolysis of terminal non reducing β D galactose residues in β D galactosides. β Galactosides include carbohydrates containing galactose where the glycosidic bond lies above the galactose molecule. Substrates of different β galactosidases include ganglioside GM1, lactosylceramides, lactose, and various glycoproteins.
Функция
β-галактозидаза – галактоза мен оның органикалық бөлігі арасындағы β-гликозидтік байланысты гидролиздейтін экзогликозидаза. Ол фукозидтер мен арабинозидтерді де ыдырата алады, бірақ тиімділігі айтарлықтай төмен. Бұл адам организміндегі маңызды фермент. Ақуыздың жетіспеушілігі галактозиалидоз немесе Моркио B синдромына алып келуі мүмкін. *E. coli*-де *lacZ* гені β-галактозидазаның құрылымдық гені болып табылады; ол индукцияланатын *lac* оперонының бір бөлігі ретінде кездеседі, ол глюкоза деңгейі төмен болғанда лактозаның қатысуымен белсендіріледі. Глюкоза деңгейі жеткілікті болған кезде β-галактозидазаның синтезі тоқтатылады. β-галактозидазаның ұқсас тізбектерге негізделген көптеген гомологтары бар. Олардың ішінде эволюциялаған β-галактозидаза (EBG), β-глюкозидаза, 6-фосфо-β-галактозидаза, β-маннозидаза және лактаза-флорзин гидролаза бар. Олардың құрылымы ұқсас болғанымен, олардың әрқайсысының функциясы әртүрлі. Бета-галь L-рибозамен және бәсекелес тежеушілермен – 2-фенилэтил-1-тио-β-D-галактопиранозид (PETG), D-галактонолактон, изопропил-тио-β-D-галактозид (IPTG) және галактозамен тежеледі. β-галактозидаза организмдер үшін маңызды, себебі ол энергия өндірілуіндегі негізгі көмекші және лактозаны галактоза мен глюкозаға ыдырату арқылы көміртегінің көзі болып табылады. Сондай-ақ, ол лактозаға төзбейтін адамдар үшін маңызды, себебі лактозасыз сүт және басқа да сүт өнімдерін жасауға жауапты. Көптеген ересек адамдарда β-галактозидазамен бірдей функцияны атқаратын лактаза ферменті жетіспейді, сондықтан олар сүт өнімдерін тиісті түрде қорыта алмайды. β-галактоза йогурт, айран және кейбір ірімшіктер сияқты сүт өнімдерінде қолданылады, олар адам тұтыну алдында лактозаны ыдырату үшін ферментпен өңделеді. Соңғы жылдары β-галактозидаза гендік алмастыру терапиясы арқылы лактозаға төзбеушілікті емдеудің әлеуеті ретінде зерттелді, онда оны адам ДНК-сына енгізуге болады, соның арқасында адамдар лактозаны өздігінен ыдырата алады.
β Galactosidase is an exoglycosidase which hydrolyzes the β glycosidic bond formed between a galactose and its organic moiety. It may also cleave fucosides and arabinosides but with much lower efficiency. It is an essential enzyme in the human body. Deficiencies in the protein can result in galactosialidosis or Morquio B syndrome. In E. coli, the lacZ gene is the structural gene for β galactosidase; which is present as part of the inducible system lac operon which is activated in the presence of lactose when glucose level is low. β Galactosidase synthesis stops when glucose levels are sufficient. β Galactosidase has many homologues based on similar sequences. A few are evolved β galactosidase (EBG), β glucosidase, 6 phospho β galactosidase, β mannosidase, and lactase phlorizin hydrolase. Although they may be structurally similar, they all have different functions. Beta gal is inhibited by L ribose and by competitive inhibitors 2 phenylethyl 1 thio β D galactopyranoside (PETG), D galactonolactone, isopropyl thio β D galactoside (IPTG), and galactose. β Galactosidase is important for organisms as it is a key provider in the production of energy and a source of carbons through the break down of lactose to galactose and glucose. It is also important for the lactose intolerant community as it is responsible for making lactose free milk and other dairy products. Many adult humans lack the lactase enzyme, which has the same function as β galactosidase, so they are not able to properly digest dairy products. β Galactose is used in such dairy products as yogurt, sour cream, and some cheeses which are treated with the enzyme to break down any lactose before human consumption. In recent years, β galactosidase has been researched as a potential treatment for lactose intolerance through gene replacement therapy where it could be placed into the human DNA so individuals can break down lactose on their own.
Құрылымы
1983 жылы E. coli β-галактозидазасының 1023 аминқышқылы тізбектелді, ал оның құрылымы он бір жыл өткен соң, 1994 жылы анықталды. Бұл ақуыз 2,2,2 нүктелік симметрияға ие 464 кДа гомотетрамер болып табылады. β-галактозидазаның әрбір бірлігі бес доменнен тұрады: 1-домен – «желли ролл» типіндегі β-цилиндр, 2- және 4-домендер – фибронектин III типіндегі цилиндрлер, 5-домен – жаңа β-сендвич, ал орталық 3-домен – бұрысқан TIM типіндегі цилиндр, онда бесінші спираль жоқ және алтыншы жіп бұрмаланған. Активті орталық тетрамердің екі суббірлігінен құралған элементтерден тұрады, ал тетрамердің димерлерге ыдырауы активті орталықтың маңызды элементтерін жояды. α-комплементацияға қатысатын β-галактозидазаның аминтерминалдық тізбегіндегі α-пептиді суббірлік интерфейсіне қатысады. Оның 22–31 қалдықтары осы интерфейстің басты бөлігін құрайтын төрт спиральді шоғырды тұрақтандыруға көмектеседі, ал 13 және 15 қалдықтары да активтендіру интерфейсіне үлес қосады. Бұл құрылымдық ерекшеліктер α-комплементация құбылысын түсіндіреді, онда аминтерминалды сегменттің жойылуы белсенді емес димердің пайда болуына алып келеді.
The 1,023 amino acids of E. coli β galactosidase were sequenced in 1983, and its structure determined eleven years later in 1994. The protein is a 464 kDa homotetramer with 2,2,2 point symmetry. Each unit of β galactosidase consists of five domains; domain 1 is a jelly roll type β barrel, domain 2 and 4 are fibronectin type III like barrels, domain 5 a novel β sandwich, while the central domain 3 is a distorted TIM type barrel, lacking the fifth helix with a distortion in the sixth strand. The active site is made up of elements from two subunits of the tetramer, and disassociation of the tetramer into dimers removes critical elements of the active site. The amino terminal sequence of β galactosidase, the α peptide involved in α complementation, participates in a subunit interface. Its residues 22–31 help to stabilize a four helix bundle which forms the major part of that interface, and residue 13 and 15 also contributing to the activating interface. These structural features provide a rationale for the phenomenon of α complementation, where the deletion of the amino terminal segment results in the formation of an inactive dimer.
Реакция
β Галактозидаза организмдерде үш түрлі реакцияны катализдей алады. Біреуінде, ол аллолактоза жасау үшін трансгалактозилдеу процесінен өтеді, β-галактозаның өндірісі үшін оң кері байланыс циклын құрайды. Аллолактоза моносахаридтерге де ыдырай алады. Сонымен қатар, лактозаны галактоза мен глюкозаға гидролиздей алады, олар гликолизге түседі. Ферменттің оңтайлы активтілігі үшін моновалентті калий иондары (K+) және дивалентті магний иондары (Mg2+) қажет. Субстраттың β-байланысын глутамин қышқылының бүйір тізбегіндегі терминалды карбоксил тобы үзеді. E. coli-де Glu 461 алмасу реакциясындағы нуклеофил деп есептелді. Алайда, қазір Glu 461 қышқыл катализаторы екені белгілі. Оның орнына Glu 537 галактицил аралық қосылысына байланысатын нақты нуклеофил. Адамдарда гидролиз реакциясының нуклеофилі – Glu 268. Gly794 β-галактозидаза активтілігі үшін маңызды. Ол ферментті "жабық", лигандпен байланысқан конформацияға немесе "ашық" конформацияға орналастыруға жауапты, белсенді ортаққа "ілмек" сияқты әрекет етеді. Әртүрлі конформациялар белсенді ортақта тек қана қалаулы байланыстың пайда болуын қамтамасыз етеді. Баяу субстрат болғанда Gly794 активтілігі артады, сондай-ақ галактозилдеудің жоғарылауы және дегалактозилдеудің төмендеуі байқалады. Белсенді ферментті 5-бром-4-хлор-3-индолил β-D-галактопиранозид, X-gal қолданып анықтауға болады. β-галактозидаза X-gal-дағы гликозидтік байланысты кесіп, галактоза мен 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндолды құрайды, ол димеризацияланып, 5,5'-дибром-4,4'-дихлор индигоға тотығады – анықтауға және өлшеуге оңай көк түсті өнім. Оның өндірісін аллолактозаның гидролизделмейтін аналогы IPTG ынталандыра алады, ол lac репрессорын lac операторынан босатып, транскрипцияның басталуына мүмкіндік береді. Ол молекулалық биологияда ген экспрессиясын бақылау үшін репортерлік маркер ретінде кеңінен қолданылады. Сондай-ақ, рекомбинантты клондарды көк/ақ скринингке негіз болатын α-комплементация деп аталатын құбылыс байқалады. Бұл фермент екі пептидке бөлінуі мүмкін: LacZα және LacZΩ, олардың ешқайсысы өздігінен активті емес, бірақ екеуі бірге болғанда функционалды ферментке спонтанды түрде қайта жиналады. Бұл қасиет көптеген клондау векторларында пайдаланылады, онда плазмидтегі lacZα генінің болуы E. coli-ның белгілі бір зертханалық штаммдарында LacZΩ-ны кодтайтын басқа мутант генді транс-комплементтей алады. Алайда, векторға ДНК фрагменттері енгізілген кезде LacZα өндірісі бұзылады, сондықтан жасушаларда β-галактозидаза активтілігі байқалмайды. Белсенді β-галактозидазаның бар-жоғын X-gal арқылы анықтауға болады, ол β-галактозидазамен ыдырағанда ерекше көк бояуды шығарады, осылайша плазмидтегі клондалған өнімнің бар-жоғын оңай ажыратуға мүмкіндік береді. Лейкемиялық хромосомалық транслокацияларды зерттеуде Добсон және әріптестері егешқұйрықтарда LacZ синтез ақуызын пайдаланып, β-галактозидазаның олигомеризацияға бейімділігін пайдаланып, MLL синтез ақуызының функциясындағы олигомерикалық қасиеттің ықтимал рөлін ұсынды. 2020–2021 жылдары жүргізілген соңғы зерттеулер β-галактозидаза активтілігі жасушалардың қартаюымен байланысты екенін анықтады. Жасушалардың қартаюы – бұл жасушалардың бөлінбейтіні, бірақ өлмейтінін білдіреді. β-галактозидаза активтілігі артық өркендеуі мүмкін, бұл дене жүйелерінің кең ауқымына әсер ететін әртүрлі ауруларға әкелуі мүмкін. Бұл жүйелерге жүрек-қан тамыр жүйесі, сүйек жүйесі және тағы басқалары жатады. Қартайған жасушаларды анықтау лизосомалық β-галактозидаза активтілігін өлшеу арқылы жүзеге асырылады. Жаңа β-галактозидаза изоформасы, рН 6,0-да оңтайлы активтілігі бар (Senescence Associated beta gal немесе SA β-gal), ол ерекше түрде қартаюда (жасушалардың өсуінің қайтымсыз тоқтауы) көрінеді. Оны анықтау үшін арнайы сандық әдістер әзірленген. Алайда, қазір бұл лизосомалық эндогенді β-галактозидазаның шамадан тыс экспрессиясы мен жинақталуына байланысты екені белгілі және оның экспрессиясы қартаю үшін қажет емес. Дегенмен, ол қартайған және қарт жасушалар үшін ең көп қолданылатын биомаркер болып қала береді, өйткені ол сенімді және анықтауға оңай.
β Galactosidase can catalyze three different reactions in organisms. In one, it can go through a process called transgalactosylation to make allolactose, creating a positive feedback loop for the production of β galactose. Allolactose can also be cleaved to form monosaccharides. It can also hydrolyze lactose into galactose and glucose which will proceed into glycolysis. Monovalent potassium ions (K+) as well as divalent magnesium ions (Mg2+) are required for the enzyme's optimal activity. The β linkage of the substrate is cleaved by a terminal carboxyl group on the side chain of a glutamic acid. In E. coli, Glu 461 was thought to be the nucleophile in the substitution reaction. However, it is now known that Glu 461 is an acid catalyst. Instead, Glu 537 is the actual nucleophile, binding to a galactosyl intermediate. In humans, the nucleophile of the hydrolysis reaction is Glu 268. Gly794 is important for β galactosidase activity. It is responsible for putting the enzyme in a "closed", ligand bounded, conformation or "open" conformation, acting like a "hinge" for the active site loop. The different conformations ensure that only preferential binding occurs in the active site. In the presence of a slow substrate, Gly794 activity increased as well as an increase in galactosylation and decrease in degalactosylation. An active enzyme may be detected using artificial chromogenic substrate 5 bromo 4 chloro 3 indolyl β D galactopyranoside, X gal. β galactosidase will cleave the glycosidic bond in X gal and form galactose and 5 bromo 4 chloro 3 hydroxyindole which dimerizes and oxidizes to 5,5' dibromo 4,4' dichloro indigo, an intense blue product that is easy to identify and quantify. Its production may be induced by a non hydrolyzable analog of allolactose, IPTG, which binds and releases the lac repressor from the lac operator, thereby allowing the initiation of transcription to proceed. It is commonly used in molecular biology as a reporter marker to monitor gene expression. It also exhibits a phenomenon called α complementation which forms the basis for the blue/white screening of recombinant clones. This enzyme can be split in two peptides, LacZα and LacZΩ, neither of which is active by itself but when both are present together, spontaneously reassemble into a functional enzyme. This property is exploited in many cloning vectors where the presence of the lacZα gene in a plasmid can complement in trans another mutant gene encoding the LacZΩ in specific laboratory strains of E. coli. However, when DNA fragments are inserted in the vector, the production of LacZα is disrupted, the cells therefore show no β galactosidase activity. The presence or absence of an active β galactosidase may be detected by X gal, which produces a characteristic blue dye when cleaved by β galactosidase, thereby providing an easy means of distinguishing the presence or absence of cloned product in a plasmid. In studies of leukaemia chromosomal translocations, Dobson and colleagues used a fusion protein of LacZ in mice, exploiting β galactosidase's tendency to oligomerise to suggest a potential role for oligomericity in MLL fusion protein function. A recent study conducted in 2020–2021 determined that Beta Galactosidase activity correlates with senescence of the cells. Senescence of the cells can be interpreted as cells that do not divide, but cells that do not die. Beta Galactosidase activity can be overexpressed, and this can lead to various diseases afflicting a wide range of body systems. These systems include the cardiovascular system, skeletal system, and many more. Detecting senescence cells can be achieved by measuring the lysosomal Beta Galactosidase activity. A new isoform for beta galactosidase with optimum activity at pH 6.0 (Senescence Associated beta gal or SA beta gal) which is specifically expressed in senescence (the irreversible growth arrest of cells). Specific quantitative assays were even developed for its detection. However, it is now known that this is due to an overexpression and accumulation of the lysosomal endogenous beta galactosidase, and its expression is not required for senescence. Nevertheless, it remains the most widely used biomarker for senescent and aging cells, because it is reliable and easy to detect.
Эволюция
Бактериялардың кейбір түрлері, соның ішінде E. coli, қосымша β-галактозидаза гендеріне ие. Эволюцияланған β-галактозидаза (ebgA) деп аталатын екінші ген, lacZ гені жойылған (бірақ галактозидтік пермеаза, lacY генін сақтайтын) штаммдар лактозаны (немесе басқа 3 галактозидті) жалғыз көміртек көзі ретінде қамтитын ортаға егілген кезде табылды. Бір уақыттан кейін, белгілі бір колониялар өсе бастады. Дегенмен, EbgA протеині тиімді лактаза емес және лактозада өсуге мүмкіндік бермейді. Екі класс бірнүктелік мутациялар лактозаға қатысты ebg ферментінің активтілігін күрт жақсартады, нәтижесінде мутацияланған фермент lacZ β-галактозидазасын ығыстыра алады. EbgA және LacZ ДНҚ деңгейінде 50%-ға, ал аминқышқылдары деңгейінде 33%-ға сәйкес келеді. Активті ebg ферменті – ebgA және ebgC гендерінің өнімдерінің 1:1 қатынастағы агрегаты, ал ebg ферменттерінің активті түрі α4 β4 гетерооктамер болып табылады.
Some species of bacteria, including E. coli, have additional β galactosidase genes. A second gene, called evolved β galactosidase (ebgA) gene was discovered when strains with the lacZ gene deleted (but still containing the gene for galactoside permease, lacY), were plated on medium containing lactose (or other 3 galactosides) as sole carbon source. After a time, certain colonies began to grow. However, the EbgA protein is an ineffective lactase and does not allow growth on lactose. Two classes of single point mutations dramatically improve the activity of ebg enzyme toward lactose. and, as a result, the mutant enzyme is able to replace the lacZ β galactosidase. EbgA and LacZ are 50% identical on the DNA level and 33% identical on the amino acid level. The active ebg enzyme is an aggregate of ebgA gene and ebgC gene products in a 1:1 ratio with the active form of ebg enzymes being an α4 β4 hetero octamer.
Түрлердің таралуы
β-галактозидазаға қатысты көптеген жұмыстар E. coli бактериясынан алынған. Дегенмен, бұл фермент көптеген өсімдіктерде (әсіресе жемістерде), сүтқоректілерде, ашытқыларда, бактерияларда және саңырауқұлақтарда кездеседі. β-галактозидаза гендері кодтау тізбегінің ұзындығы және аминокислоталардан құралған ақуыздардың ұзындығы бойынша айырмашылықтарға ие болуы мүмкін. Осыған байланысты β-галактозидазалар төрт отбасыға бөлінеді: GHF 1, GHF 2, GHF 35 және GHF 42. E. coli GHF 2 отбасына жатады, барлық өсімдіктер GHF 35 отбасына, ал Thermus thermophilus GHF 42 отбасына жатады. Персиктердің жұмсаруын анықтауға бағытталған зерттеуде β-галактозидазаның 17 түрлі гендік экспрессиясы табылды. β-галактозидазаның тағы бір белгілі кристалдық құрылымы Thermus thermophilus-тан ғана белгілі.
Much of the work done on β galactosidase is derived from E. coli. However the enzyme can be found in many plants (especially fruits), mammals, yeast, bacteria, and fungi. β galactosidase genes can differ in the length of their coding sequence and the length of proteins formed by amino acids. This separates the β galactosidases into four families: GHF 1, GHF 2, GHF 35, and GHF 42. E. Coli belongs to GHF 2, all plants belong to GHF 35, and Thermus thermophilus belongs to GHF 42. A study targeted at identifying fruit softening of peaches found 17 different gene expressions of β galactosidases. The only other known crystal structure of β galactosidase is from Thermus thermophilus.