Бета-галактозидаза: структура, функции и применение.

Введение

Семейство гликозидных гидролазных ферментов

β-галактозидаза (EC 3.2.1.23, лактаза, бета-гал или β-гал; систематическое название – β-D-галактозидный галактогидролаза) – это гликозидный гидролазный фермент, катализирующий гидролиз концевых нередуцирующих остатков β-D-галактозы в β-D-галактозидах. β-галактозиды включают углеводы, содержащие галактозу, в которых гликозидная связь расположена над молекулой галактозы. Субстратами различных β-галактозидаз являются ганглиозид GM1, лактозилцерамиды, лактоза и различные гликопротеины.

Функция

β-галактозидаза – это экзогликозидаза, которая гидролизует β-гликозидную связь, образованную между галактозой и ее органическим компонентом. Она также может расщеплять фукозиды и арабинозиды, но с гораздо меньшей эффективностью. Это важный фермент в организме человека. Дефицит этого белка может приводить к галактозиалидозу или синдрому Моркио B. У E. coli ген lacZ является структурным геном для β-галактозидазы; он представлен как часть индуцируемой системы lac-оперона, которая активируется в присутствии лактозы при низком уровне глюкозы. Синтез β-галактозидазы прекращается при достаточном уровне глюкозы. β-галактозидаза имеет множество гомологов, основанных на схожих последовательностях. К ним относятся эволюционировавшие β-галактозидазы (EBG), β-глюкозидазы, 6-фосфо-β-галактозидазы, β-маннозидазы и лактаза-флоризингидролаза. Несмотря на структурное сходство, все они выполняют разные функции. Бета-галь ингибируется L-рибозой и конкурентными ингибиторами, такими как 2-фенилэтил-1-тио-β-D-галактопиранозид (PETG), D-галактонолактон, изопропил-тио-β-D-галактозид (IPTG) и галактоза. β-галактозидаза важна для организмов, поскольку является ключевым поставщиком энергии и источником углерода при расщеплении лактозы на галактозу и глюкозу. Она также важна для людей с непереносимостью лактозы, поскольку отвечает за производство молока без лактозы и других молочных продуктов. У многих взрослых людей отсутствует фермент лактаза, который выполняет ту же функцию, что и β-галактозидаза, поэтому они не могут должным образом переваривать молочные продукты. β-галактоза используется в таких молочных продуктах, как йогурт, сметана и некоторые сыры, которые обрабатываются этим ферментом для расщепления лактозы перед употреблением. В последние годы β-галактозидаза изучается как потенциальное средство лечения непереносимости лактозы с помощью генной терапии, при которой она может быть введена в ДНК человека, чтобы люди могли самостоятельно расщеплять лактозу.

Структура

В 1983 году была определена последовательность 1023 аминокислот β-галактозидазы E. coli, а ее структура – одиннадцать лет спустя, в 1994 году. Белок представляет собой гомотетрамер массой 464 кДа с точечной симметрией 2,2,2. Каждая субъединица β-галактозидазы состоит из пяти доменов: домен 1 – β-бочка типа желе-ролл, домены 2 и 4 – бочки, подобные фибронектиновым типа III, домен 5 – новый β-сэндвич, а центральный домен 3 – искаженная β-бочка типа TIM, лишенная пятой спирали и имеющая искажение в шестой нити. Активный центр сформирован элементами двух субъединиц тетрамера, и диссоциация тетрамера на димеры приводит к потере критически важных элементов активного центра. Аминотерминальная последовательность β-галактозидазы, α-пептид, участвующий в α-комплементации, формирует межсубъединичный интерфейс. Остатки 22–31 помогают стабилизировать четырехспиральный пучок, который составляет основную часть этого интерфейса, а остатки 13 и 15 также вносят вклад в активирующий интерфейс. Эти структурные особенности объясняют феномен α-комплементации, при котором удаление аминотерминального сегмента приводит к образованию неактивного димера.

Реакция

β-галактозидаза может катализировать три различные реакции в организмах. В одной из них она способна проходить процесс, называемый трансгалактозилированием, для образования аллолактозы, создавая положительную обратную связь для продукции β-галактозы. Аллолактоза также может расщепляться до моносахаридов. Кроме того, она способна гидролизовать лактозу до галактозы и глюкозы, которые затем поступают в гликолиз. Для оптимальной активности фермента необходимы моно- и дивалентные ионы калия (K+) и магния (Mg2+) соответственно. Бета-связь субстрата расщепляется терминальной карбоксильной группой в боковой цепи глутаминовой кислоты. В *E. coli* считалось, что Glu 461 является нуклеофилом в реакции замещения. Однако сейчас известно, что Glu 461 выступает в роли кислотного катализатора. Вместо этого, фактическим нуклеофилом является Glu 537, связывающийся с промежуточным галактозильным соединением. У человека нуклеофилом реакции гидролиза является Glu 268. Gly794 играет важную роль в активности β-галактозидазы. Он отвечает за придание ферменту "закрытой", лиганд-связанной конформации или "открытой" конформации, функционируя как "шарнир" для петли активного центра. Различные конформации обеспечивают предпочтительное связывание в активном центре. В присутствии медленного субстрата активность Gly794 возрастает, а также увеличивается галактозилирование и снижается дегалактозилирование. Активный фермент можно обнаружить с помощью искусственного хромогенного субстрата 5-бром-4-хлор-3-индолил-β-D-галактопиранозида (X-gal). β-галактозидаза расщепляет гликозидную связь в X-gal, образуя галактозу и 5-бром-4-хлор-3-гидроксииндол, который димеризуется и окисляется до 5,5'-дибром-4,4'-дихлор-индиго – интенсивного синего продукта, который легко идентифицировать и количественно определить. Его продукция может быть индуцирована негидролизуемым аналогом аллолактозы IPTG, который связывается и высвобождает лакторепрессор от лактоператора, тем самым позволяя инициировать транскрипцию. Он широко используется в молекулярной биологии в качестве репортерного маркера для мониторинга экспрессии генов. Также наблюдается явление, называемое α-комплементацией, которое лежит в основе сине-белого скрининга рекомбинантных клонов. Этот фермент может быть разделен на два пептида, LacZα и LacZΩ, ни один из которых не активен сам по себе, но при совместном присутствии они спонтанно рекомбинируют в функциональный фермент. Это свойство используется во многих клонирующих векторах, где присутствие гена *lacZα* в плазмиде может транскомплементировать другой мутантный ген, кодирующий LacZΩ, в определенных лабораторных штаммах *E. coli*. Однако, при встраивании фрагментов ДНК в вектор, продукция LacZα нарушается, и клетки не проявляют активности β-галактозидазы. Присутствие или отсутствие активной β-галактозидазы можно обнаружить с помощью X-gal, который при расщеплении β-галактозидазой образует характерную синюю окраску, тем самым обеспечивая простой способ отличить наличие или отсутствие клонированного продукта в плазмиде. В исследованиях хромосомных транслокаций при лейкемии, Добсон и его коллеги использовали белок-слияние LacZ у мышей, используя склонность β-галактозидазы к олигомеризации, чтобы предположить потенциальную роль олигомеризации в функции белка-слияния MLL. Недавнее исследование, проведенное в 2020–2021 годах, показало, что активность β-галактозидазы коррелирует с клеточным старением. Клеточное старение можно интерпретировать как состояние, при котором клетки перестают делиться, но не умирают. Активность β-галактозидазы может быть сверхэкспрессирована, что может приводить к различным заболеваниям, поражающим широкий спектр систем организма, включая сердечно-сосудистую, скелетную и многие другие. Обнаружение стареющих клеток можно осуществить путем измерения активности лизосомной β-галактозидазы. Существует новая изоформа β-галактозидазы с оптимальной активностью при pH 6,0 (β-галактозидаза, связанная со старением, или SA-β-gal), которая специфически экспрессируется при старении (необратимой остановке роста клеток). Для ее обнаружения были разработаны даже специальные количественные анализы. Однако сейчас известно, что это связано со сверхэкспрессией и накоплением эндогенной лизосомной β-галактозидазы, и ее экспрессия не требуется для старения. Тем не менее, она остается наиболее широко используемым биомаркером стареющих клеток, поскольку является надежной и легко обнаруживаемой.

β Galactosidase can catalyze three different reactions in organisms. In one, it can go through a process called transgalactosylation to make allolactose, creating a positive feedback loop for the production of β galactose. Allolactose can also be cleaved to form monosaccharides. It can also hydrolyze lactose into galactose and glucose which will proceed into glycolysis. Monovalent potassium ions (K+) as well as divalent magnesium ions (Mg2+) are required for the enzyme's optimal activity. The β linkage of the substrate is cleaved by a terminal carboxyl group on the side chain of a glutamic acid. In E. coli, Glu 461 was thought to be the nucleophile in the substitution reaction. However, it is now known that Glu 461 is an acid catalyst. Instead, Glu 537 is the actual nucleophile, binding to a galactosyl intermediate. In humans, the nucleophile of the hydrolysis reaction is Glu 268. Gly794 is important for β galactosidase activity. It is responsible for putting the enzyme in a "closed", ligand bounded, conformation or "open" conformation, acting like a "hinge" for the active site loop. The different conformations ensure that only preferential binding occurs in the active site. In the presence of a slow substrate, Gly794 activity increased as well as an increase in galactosylation and decrease in degalactosylation. An active enzyme may be detected using artificial chromogenic substrate 5 bromo 4 chloro 3 indolyl β D galactopyranoside, X gal. β galactosidase will cleave the glycosidic bond in X gal and form galactose and 5 bromo 4 chloro 3 hydroxyindole which dimerizes and oxidizes to 5,5' dibromo 4,4' dichloro indigo, an intense blue product that is easy to identify and quantify. Its production may be induced by a non hydrolyzable analog of allolactose, IPTG, which binds and releases the lac repressor from the lac operator, thereby allowing the initiation of transcription to proceed. It is commonly used in molecular biology as a reporter marker to monitor gene expression. It also exhibits a phenomenon called α complementation which forms the basis for the blue/white screening of recombinant clones. This enzyme can be split in two peptides, LacZα and LacZΩ, neither of which is active by itself but when both are present together, spontaneously reassemble into a functional enzyme. This property is exploited in many cloning vectors where the presence of the lacZα gene in a plasmid can complement in trans another mutant gene encoding the LacZΩ in specific laboratory strains of E. coli. However, when DNA fragments are inserted in the vector, the production of LacZα is disrupted, the cells therefore show no β galactosidase activity. The presence or absence of an active β galactosidase may be detected by X gal, which produces a characteristic blue dye when cleaved by β galactosidase, thereby providing an easy means of distinguishing the presence or absence of cloned product in a plasmid. In studies of leukaemia chromosomal translocations, Dobson and colleagues used a fusion protein of LacZ in mice, exploiting β galactosidase's tendency to oligomerise to suggest a potential role for oligomericity in MLL fusion protein function. A recent study conducted in 2020–2021 determined that Beta Galactosidase activity correlates with senescence of the cells. Senescence of the cells can be interpreted as cells that do not divide, but cells that do not die. Beta Galactosidase activity can be overexpressed, and this can lead to various diseases afflicting a wide range of body systems. These systems include the cardiovascular system, skeletal system, and many more. Detecting senescence cells can be achieved by measuring the lysosomal Beta Galactosidase activity. A new isoform for beta galactosidase with optimum activity at pH 6.0 (Senescence Associated beta gal or SA beta gal) which is specifically expressed in senescence (the irreversible growth arrest of cells). Specific quantitative assays were even developed for its detection. However, it is now known that this is due to an overexpression and accumulation of the lysosomal endogenous beta galactosidase, and its expression is not required for senescence. Nevertheless, it remains the most widely used biomarker for senescent and aging cells, because it is reliable and easy to detect.

Эволюция

Некоторые виды бактерий, включая E. coli, имеют дополнительные гены β-галактозидазы. Второй ген, названный геном эволюционировавшей β-галактозидазы (ebgA), был обнаружен, когда штаммы с делетированным геном lacZ (но все еще содержащие ген галактозидной пермеазы, lacY), высевали на среду, содержащую лактозу (или другие 3-галактозиды) в качестве единственного источника углерода. Через некоторое время отдельные колонии начали расти. Однако белок EbgA является неэффективным лактазой и не обеспечивает рост на лактозе. Два класса точечных мутаций значительно повышают активность фермента ebg по отношению к лактозе, и в результате мутантный фермент способен заменить β-галактозидазу LacZ. EbgA и LacZ имеют 50% идентичности на уровне ДНК и 33% идентичности на уровне аминокислот. Активный фермент ebg представляет собой агрегат продуктов генов ebgA и ebgC в соотношении 1:1, при этом активная форма фермента ebg является гетерооктамером α4β4.

Распределение видов

Большая часть исследований β-галактозидазы проведена на основе E. coli. Однако этот фермент встречается во многих растениях (особенно в плодах), млекопитающих, дрожжах, бактериях и грибах. Гены β-галактозидазы могут различаться по длине кодирующей последовательности и длине образуемых аминокислотных цепочек. Это разделяет β-галактозидазы на четыре семейства: GHF 1, GHF 2, GHF 35 и GHF 42. E. coli относится к GHF 2, все растения – к GHF 35, а Thermus thermophilus – к GHF 42. Исследование, направленное на выявление механизмов размягчения плодов персиков, обнаружило 17 различных экспрессий генов β-галактозидазы. Единственная другая известная кристаллическая структура β-галактозидазы получена из Thermus thermophilus.