Адено-ассоциирленген вирустар: қасиеттері және гендік терапиядағы қолданысы
Adeno-associated virus
Аденовирустарға қатысты вирустар (AAV) – гендік терапияда қолданылатын, қауіпсіз, кішкентай вирустар. ДНК құрамы, инфекциялық қасиеттері туралы ақпарат.
Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Вирустың түрлері
Species of virus
Адено-ассоцияланған вирустар (ААВ) – адамдар мен кейбір басқа примат түрлерін жұқтыратын шағын вирустар. Олар өз кезегінде Parvoviridae тұқымдасына жататын Dependoparvovirus туысына жатады. Олардың диаметрі шамамен 26 нм, репликацияға қабілетсіз, қаптамасы жоқ вирустар және шамамен 4,8 килобазалық (кб) сызықтық бір тізбекті ДНК (ssDNA) геномы бар. Бірнеше ерекшелік ААВ-ны гендік терапия үшін вирустық векторлар жасауға және адам ауруларының изогендік үлгілерін құруға ыңғайлы кандидат етеді. ААВ-ны қолданатын гендік терапия векторлары бөлінетін және тыныш жасушаларды жұқтыра алады және қабылдаушы жасушаның геномына енбей, хромосомадан тыс күйде сақталады. Дегенмен, табиғи вируста вирустың тасымалдаған гендері қабылдаушы геномға енуі мүмкін. Интеграция кейбір қолданулар үшін маңызды болуы мүмкін, бірақ ол күтілмеген салдарларға да әкелуі мүмкін. Жақында адамдарда жүргізілген клиникалық сынақтарда ААВ-ны көздің торына гендік терапия жасауда үміттендірерлік нәтижелер көрсетілді. 2023 жылдың наурыз айында Nature журналында балалар гепатитінің толқынынан алынған сынамаларда аденовирус пен герпесвирустармен қатар адено-ассоцияланған 2 вирусының (AAV2) жоғары титрі анықталды. Бір мақалада AAV2 коинфекциясының аденовирус немесе герпесвируспен жұққанға қарағанда бауыр ауруын күрделендіруі мүмкін екендігі және себеп-салдар байланысын анықтау қажеттігі айтылды.
Adeno associated viruses (AAV) are small viruses that infect humans and some other primate species. They belong to the genus Dependoparvovirus, which in turn belongs to the family Parvoviridae. They are small (approximately 26 nm in diameter) replication defective, nonenveloped viruses and have linear single stranded DNA (ssDNA) genome of approximately 4.8 kilobases (kb). Several features make AAV an attractive candidate for creating viral vectors for gene therapy, and for the creation of isogenic human disease models. Gene therapy vectors using AAV can infect both dividing and quiescent cells and persist in an extrachromosomal state without integrating into the genome of the host cell. In the native virus, however, integration of virally carried genes into the host genome does occur. Integration can be important for certain applications, but can also have unwanted consequences. Recent human clinical trials using AAV for gene therapy in the retina have shown promise. In March 2023, a series of Nature papers detected high titres of adeno associated virus 2 (AAV2), alongside adenovirus and herpesvirus, in samples from a wave of childhood hepatitis. One paper suggested that AAV2 co infection may contribute to more serious liver disease than infection with only adeno or herpesviruses and that the causal link remains to be established.
Тарих
Адено ассоцияланған вирус (AAV), бұрын аденовирус препараттарындағы қоспа деп есептелген, алғаш рет 1960 жылдары Питтсбургтегі Боб Атчисон және NIH-дегі Уоллес Роу зертханаларында тәуелді парвовирус ретінде анықталды. Кейіннен адамдарда жүргізілген серологиялық зерттеулер ААВ-ның өзі, аденовирус немесе герпес вирусы сияқты көмекші вирустармен жұққан адамдарда болғанына қарамастан, ешқандай ауруға себеп болмайтынын көрсетті.
The adeno associated virus (AAV), previously thought to be a contaminant in adenovirus preparations, was first identified as a dependoparvovirus in the 1960s in the laboratories of Bob Atchison at Pittsburgh and Wallace Rowe at NIH. Serological studies in humans subsequently indicated that, despite being present in people infected by helper viruses such as adenovirus or herpes virus, AAV itself did not cause any disease.
Артықшылықтары мен кемшіліктері
Жануарлар түріндегі ААВ бірнеше ерекшеліктеріне байланысты гендік терапия зерттеушілерінің қызығушылығын тудырды. Олардың бастысы – вирустың патогендік қабілетінің болмауы. Ол бөлінбейтін жасушаларды жұқтыра алады және адамның 19-шы хромосомасындағы белгілі бір нүктеге (ААВС1 деп аталады) қоныс жасуша геномына тұрақты түрде кіріге алады. Бұл ерекшелік ретровирустарға қарағанда оны болжауға оңайырақ жасайды, себебі ретровирустар кездейсоқ ену және мутагенез қаупін тудырады, кейде оған қатерлі ісік дамуы да ілеседі. ААВ геномы көбінесе аталған нүктеге біріктіріледі, ал геномға кездейсоқ кірігулер өте сирек кездеседі. Дегенмен, ААВ-ны гендік терапия векторы ретінде дамыту, вектор ДНК-сынан репликатор және капсидті алып тастау арқылы осы кірігу қабілетін жойды. Қажетті ген, геннің транскрипциясын қамтамасыз ететін промотормен бірге, ядрода конкатемерлердің түзілуіне көмектесетін кері терминалдық қайталаулардың (ITR) арасына енгізіледі. Мұнда бір тізбекті векторлық ДНК, жасушаның ДНК полимераза кешендері арқылы қос тізбекті ДНК-ға айналады. ААВ негізделген гендік терапия векторлары жасуша ядросында эпизомалық конкатемерлерді құрайды. Бөлінбейтін жасушаларда бұл конкатемерлер жасушаның өмірі бойы сақталады. Бөлінетін жасушаларда ААВ ДНК жасушалар бөлінуі кезінде жоғалады, себебі эпизомалық ДНК жасуша геномымен бірге көбейтілмейді. ААВ ДНК-ның кездейсоқ кірігуі анықталады, бірақ өте сирек болады. Бұл ерекшелік, тыныш жасушаларды жұқтыру қабілетімен бірге, адам гендік терапиясы үшін вектор ретінде аденовирустардан басымдық береді. Вирусты қолданудың кейбір кемшіліктері де бар. Вектордың клондау қабілеті салыстырмалы түрде шектеулі, ал көптеген терапиялық гендер вирустың 4,8 килобазалық геномын толық алмастыруды қажет етеді. Сондықтан үлкен гендер стандартты ААВ векторында қолдануға жарамсыз. Қазіргі уақытта кодтау қабілетінің шектеулілігін жою үшін әртүрлі мүмкіндіктер қарастырылуда. Екі геномның ААВ ITR-лері бас-құйрық конкатемерлерін құру үшін біріктіріле алады, бұл вектордың сыйымдылығын екі есеге дейін арттырады. Сплис-сайттарды енгізу транскрипттен ITR-ді алып тастауға мүмкіндік береді. ААВ-ның гендік терапиядағы ерекше артықшылықтарына байланысты зерттеушілер ААВ-ның өздігінен толықтыратын (scAAV) өзгертілген нұсқасын жасады. ААВ бір ДНК тізбегін жинаса, екінші тізбегі синтезделуін күтуі керек болса, scAAV бірін-бірі толықтыратын екі қысқа тізбекті жинақтайды. Екінші тізбекті синтездеуді болдырмау арқылы scAAV тезірек экспрессияны қамтамасыз етеді, бірақ scAAV AAV-ның шектеулі сыйымдылығының жартысын ғана кодтай алады. Соңғы есептер scAAV векторларының бір тізбекті аденовирустық векторларға қарағанда иммуногендірек екенін және цитотоксикалық Т-лимфоциттерін күштірек белсендіретінін көрсетеді. Жабайы түрдегі инфекциядан туындаған иммунитет жиі кездеседі. Осыған байланысты нейтрализациялау белсенділігі ең көп қолданылатын ААV2 серотипінің тиімділігін шектейді. Сәйкесінше, жүргізіліп жатқан клиникалық зерттеулердің көпшілігі AAV2-ні иммунологиялық жағынан ерекше ерекшеліктері бар ағзаға – миға енгізуді қамтиды. Мида AAV2 нейронға ерекше тән.
Wild type AAV has attracted considerable interest from gene therapy researchers due to a number of features. Chief amongst these was the virus's apparent lack of pathogenicity. It can also infect non dividing cells and has the ability to stably integrate into the host cell genome at a specific site (designated AAVS1) in the human chromosome 19. This feature makes it somewhat more predictable than retroviruses, which present the threat of a random insertion and of mutagenesis, which is sometimes followed by development of a cancer. The AAV genome integrates most frequently into the site mentioned, while random incorporations into the genome take place with a negligible frequency. Development of AAVs as gene therapy vectors, however, has eliminated this integrative capacity by removal of the rep and cap from the DNA of the vector. The desired gene together with a promoter to drive transcription of the gene is inserted between the inverted terminal repeats (ITRs) that aid in concatemer formation in the nucleus after the single stranded vector DNA is converted by host cell DNA polymerase complexes into double stranded DNA. AAV based gene therapy vectors form episomal concatemers in the host cell nucleus. In non dividing cells, these concatemers remain intact for the life of the host cell. In dividing cells, AAV DNA is lost through cell division, since the episomal DNA is not replicated along with the host cell DNA. Random integration of AAV DNA into the host genome is detectable but occurs at very low frequency. This feature, along with the ability to infect quiescent cells present their dominance over adenoviruses as vectors for human gene therapy. Use of the virus does present some disadvantages. The cloning capacity of the vector is relatively limited and most therapeutic genes require the complete replacement of the virus's 4.8 kilobase genome. Large genes are, therefore, not suitable for use in a standard AAV vector. Options are currently being explored to overcome the limited coding capacity. The AAV ITRs of two genomes can anneal to form head to tail concatemers, almost doubling the capacity of the vector. Insertion of splice sites allows for the removal of the ITRs from the transcript. Because of AAV's specialized gene therapy advantages, researchers have created an altered version of AAV termed self complementary adeno associated virus (scAAV). Whereas AAV packages a single strand of DNA and must wait for its second strand to be synthesized, scAAV packages two shorter strands that are complementary to each other. By avoiding second strand synthesis, scAAV can express more quickly, although as a caveat, scAAV can only encode half of the already limited capacity of AAV. Recent reports suggest that scAAV vectors are more immunogenic than single stranded adenovirus vectors, inducing a stronger activation of cytotoxic T lymphocytes. Humoral immunity instigated by infection with the wild type is thought to be common. The associated neutralising activity limits the usefulness of the most commonly used serotype AAV2 in certain applications. Accordingly, the majority of clinical trials under way involve delivery of AAV2 into the brain, a relatively immunologically privileged organ. In the brain, AAV2 is strongly neuron specific.
Геном, транскриптомика және протеомика
AAV геномдары оң немесе теріс сезімтал, бір тізбекті дезоксирибонуклеин қышқылынан (ssDNA) тұрады, оның ұзындығы шамамен 4,7 килобаза. Геномның екі басында ITR-лер орналасқан, сондай-ақ екі ашық оқу кадры (ORF) бар: rep және cap. Біріншісі ААВ тіршілік циклы үшін қажетті Rep ақуыздарын кодтайтын, бірін-біріңізге үстігіп жатқан төрт геннен тұрады, ал екіншісі капсид ақуыздарының нуклеотидтік тізбектерін: VP1, VP2 және VP3 қамтиды, олар бір-бірімен өзара әрекеттесіп, икосаэдрлік симметриялы капсид құрайды.
The AAV genome is built of single stranded deoxyribonucleic acid (ssDNA), either positive or negative sensed, which is about 4.7 kilobase long. The genome comprises ITRs at both ends of the DNA strand, and two open reading frames (ORFs): rep and cap. The former is composed of four overlapping genes encoding Rep proteins required for the AAV life cycle, and the latter contains overlapping nucleotide sequences of capsid proteins: VP1, VP2 and VP3, which interact to form a capsid with icosahedral symmetry.
ITR реттілігі
Қайтарылған терминалдық қайталау (ITR) тізбектерінің әрқайсысы 145 негізден тұрады. Олар осы симметриясы үшін осылай аталды, себебі AAV геномының тиімді көбеюі үшін бұл симметрия қажет екені көрсетілді. Бұл тізбектердің осы қасиетке ие болуына себеп – шаштық тігіп алу қабілеті, ол екінші ДНК тізбегінің примазаға тәуелсіз синтезіне мүмкіндік беретін, өзін-өзі бастау деп аталатын процеске ықпал етеді. ITR-лер AAV ДНК-ның қабылдаушы жасуша геномына (адамда 19-хромосома) интеграциялануы және одан босатылуы үшін, сондай-ақ AAV ДНК-ның тиімді инкапсидациялануы және толық құралған, дезоксирибонуклеазаға төзімді AAV бөлшектерінің пайда болуы үшін де қажет екені дәлелденді. Гендік терапия тұрғысынан, ITR-лер терапиялық геннің жанында цис-конфигурацияда қажетті жалғыз тізбектер болып көрінеді: құрылымдық (кап) және қаптау (реп) белоктары транс-конфигурацияда жеткізілуі мүмкін. Осы болжамға сүйене отырып, репортерлік немесе терапиялық генді қамтитын рекомбинантты AAV (rAAV) векторларын тиімді өндірудің көптеген әдістері әзірленді. Дегенмен, ITR-лердің тиімді репликация және инкапсидация үшін цис-конфигурацияда қажетті жалғыз элемент емес екендігі де жарияланды. Бірнеше зерттеу тобы реп генінің кодтау тізбегінде орналасқан, цис-әрекетті, Реп-ке тәуелді элемент (CARE) деп аталатын тізбекті анықтады. CARE цис-конфигурацияда болғанда репликация мен инкапсидацияны күшейтетіні көрсетілді.
The inverted terminal repeat (ITR) sequences comprise 145 bases each. They were named so because of their symmetry, which was shown to be required for efficient multiplication of the AAV genome. The feature of these sequences that gives them this property is their ability to form a hairpin, which contributes to so called self priming that allows primase independent synthesis of the second DNA strand. The ITRs were also shown to be required for both integration of the AAV DNA into the host cell genome (19th chromosome in humans) and rescue from it, as well as for efficient encapsidation of the AAV DNA combined with generation of a fully assembled, deoxyribonuclease resistant AAV particles. With regard to gene therapy, ITRs seem to be the only sequences required in cis next to the therapeutic gene: structural (cap) and packaging (rep) proteins can be delivered in trans. With this assumption many methods were established for efficient production of recombinant AAV (rAAV) vectors containing a reporter or therapeutic gene. However, it was also published that the ITRs are not the only elements required in cis for the effective replication and encapsidation. A few research groups have identified a sequence designated cis acting Rep dependent element (CARE) inside the coding sequence of the rep gene. CARE was shown to augment the replication and encapsidation when present in cis.
Rep гендері мен Rep ақуыздары
Геномның "сол жағында" p5 және p19 деп аталатын екі промотор орналасқан, олардан екі жапсарлас хабаршы рибонуклеин қышқылы (мРНК) – әртүрлі ұзындықтағы екі түрлі мРНК түзілуі мүмкін. Олардың әрқайсысы интроннан тұрады, ол кесіліп шығарылуы немесе кесілмей қалуы мүмкін. Осы мүмкіндіктерді ескере отырып, төрт түрлі мРНК, демек, төрт түрлі Реп протеині – бірін-бірі жабатын тізбектерден синтезделеді. Олардың аттары килодальтонмен (кДа) өлшенген мөлшерін көрсетеді: Rep78, Rep68, Rep52 және Rep40. Rep78 және Rep68 өзінен бастау кезінде ITR құраған түйіншеге арнайы байланысып, түйіншенің ішіндегі белгілі бір аймақта – соңғы шешім орнында кесіп тастай алады. Олардың AAV геномын AAVS1-ге ерекше интеграциялау үшін қажет екені де көрсетілді. Төрт Реп протеінінің барлығы ATP-мен байланысады және геликаза активтілігіне ие. Сондай-ақ, олар p40 промоторынан (төменде айтылған) транскрипцияны күшейтеді, бірақ p5 және p19 промоторларын басады.
On the "left side" of the genome there are two promoters called p5 and p19, from which two overlapping messenger ribonucleic acids (mRNAs) of different length can be produced. Each of these contains an intron which can be either spliced out or not. Given these possibilities, four various mRNAs, and consequently four various Rep proteins with overlapping sequence can be synthesized. Their names depict their sizes in kilodaltons (kDa): Rep78, Rep68, Rep52 and Rep40. Rep78 and 68 can specifically bind the hairpin formed by the ITR in the self priming act and cleave at a specific region, designated terminal resolution site, within the hairpin. They were also shown to be necessary for the AAVS1 specific integration of the AAV genome. All four Rep proteins were shown to bind ATP and to possess helicase activity. It was also shown that they upregulate the transcription from the p40 promoter (mentioned below), but downregulate both p5 and p19 promoters.
cap гендері мен VP ақуыздары
Оң жақтың оң сезімталдық ААВ геномы үш капсидтік ақуыздың – VP1, VP2 және VP3, сондай-ақ екі қосымша ақуыздың – MAAP және AAP, бір-бірімен үстіртен жабатын тізбектерін кодтайды, олар p40 деп аталатын бір промотордан басталады. Бұл ақуыздардың молекулалық салмағы сәйкесінше 87, 72 және 62 килодальтонды құрайды. ААВ капсиді VP1, VP2 және VP3 қоспасынан тұрады, олар 1:1:10 қатынасында икосаэдрлік симметрияда орналасқан 60 мономерді құрайды, ал бос массасы шамамен 3,8 MDa. VP3 ақуызының кристалдық құрылымын Xie, Bue және авторлар тобы анықтады. Кап гені құрылымдық емес, қосымша ақуызды – Ассамблеяны белсендіретін ақуызды (AAP) шығарады. Бұл ақуыз ORF2-ден синтезделеді және капсидті құрастыру процесі үшін маңызды. Осы ақуыздың құрастыру процесіндегі нақты функциясы мен құрылымы күні бүгінге дейін анықталған жоқ. Барлық үш VP бір мРНҚ-дан трансляцияланады. Бұл мРНҚ синтезделгеннен кейін екі түрлі жолмен тілінеді: ұзын немесе қысқа интрон жойылып, 2,3 кб және 2,6 кб ұзындықтағы екі мРНҚ пулы пайда болады. Әдетте, әсіресе аденовирустың қатысуында, ұзын интронға басымдық беріледі, сондықтан 2,3 кб мРНҚ «басты тіліну» деп аталады. Бұл жағдайда VP1 ақуызының синтезі басталатын алғашқы AUG кодоны кесіліп, VP1 ақуызының синтезінің жалпы деңгейі төмендейді. Басты тілінуде қалған алғашқы AUG кодоны VP3 ақуызының басталу кодоны болып табылады. Дегенмен, осы кодонның жоғары жағындағы сол ашық оқу тізбегінде оптималды Козак контексімен шеңберленген ACG тізбегі (треонинді кодтайтын) орналасқан. Бұл VP2 ақуызының синтезінің төмен деңгейіне әкеледі, ол VP1 сияқты, қосымша N-терминалдық қалдықтары бар VP3 ақуызы болып табылады. Үлкен интронның тілінуіне басымдық берілетіндіктен және басты тілінуде ACG кодоны аударманы бастау сигналы ретінде әлсіз болғандықтан, ААВ құрылымдық ақуыздарының in vivo синтезінің қатынасы шамамен 1:1:20 құрайды, бұл жетілген вирус бөлшегіндегідей. VP1 ақуызының N-ұшындағы бірегей фрагмент фосфолипаза A2 (PLA2) активтілігіне ие екені көрсетілді, бұл, мүмкін, ААВ бөлшектерін кешкі эндосомалардан шығару үшін қажет. Муралидхар және авторлар VP2 және VP3 вирустың дұрыс құрастырылуы үшін маңызды екенін хабарлады.
The right side of a positive sensed AAV genome encodes overlapping sequences of three capsid proteins, VP1, VP2 and VP3, and two accessory proteins, MAAP & AAP, which start from one promoter, designated p40. The molecular weights of these proteins are 87, 72 and 62 kiloDaltons, respectively. The AAV capsid is composed of a mixture of VP1, VP2, and VP3 totaling 60 monomers arranged in icosahedral symmetry in a ratio of 1:1:10, with an empty mass of approximately 3.8 MDa. The crystal structure of the VP3 protein was determined by Xie, Bue, et al. The cap gene produces an additional, non structural protein called the Assembly Activating Protein (AAP). This protein is produced from ORF2 and is essential for the capsid assembly process. The exact function of this protein in the assembly process and its structure have not been solved to date. All three VPs are translated from one mRNA. After this mRNA is synthesized, it can be spliced in two different manners: either a longer or shorter intron can be excised resulting in the formation of two pools of mRNAs: a 2.3 kb and a 2.6 kb long mRNA pool. Usually, especially in the presence of adenovirus, the longer intron is preferred, so the 2.3 kb long mRNA represents the so called "major splice". In this form the first AUG codon, from which the synthesis of VP1 protein starts, is cut out, resulting in a reduced overall level of VP1 protein synthesis. The first AUG codon that remains in the major splice is the initiation codon for VP3 protein. However, upstream of that codon in the same open reading frame lies an ACG sequence (encoding threonine) which is surrounded by an optimal Kozak context. This contributes to a low level of synthesis of VP2 protein, which is actually VP3 protein with additional N terminal residues, as is VP1. Since the bigger intron is preferred to be spliced out, and since in the major splice the ACG codon is a much weaker translation initiation signal, the ratio at which the AAV structural proteins are synthesized in vivo is about 1:1:20, which is the same as in the mature virus particle. The unique fragment at the N terminus of VP1 protein was shown to possess the phospholipase A2 (PLA2) activity, which is probably required for the releasing of AAV particles from late endosomes. Muralidhar et al. reported that VP2 and VP3 are crucial for correct virion assembly.
Аудармадан кейінгі өзгерістер
Жоғары өнімділіктегі 'омикалық тәсілдер арқылы жасалған соңғы жаңалықтарға AAV капсидтерінің VP1, VP2 және VP3 капсид ақуыздарында ацетилдену, метилдену, фосфорилдену, деамидтену, O GlycNAcylation және SUMOylation сияқты посттрансляциялық модификациялар (PTM) өндіріс кезінде жүзеге асатыны жатады. Бұл PTM-дер өндіріс платформасына қарай өзгеше болады. Тағы бір жаңалық – AAV геномдары өндіріс барысында эпигенетикалық метилденуге ұшырайды. Бағадан өзге, осы жаңалыстар экспрессия кинетикасына, rAAV рецепторымен байланысуға, тасымалдануға, вектордың иммуногенділігіне және экспрессияның тұрақтылығына әсер етуі мүмкін.
Recent discoveries made through use of high throughput 'omics approaches include the fact that AAV capsids are post translationally modified (PTM) during production such as acetylation, methylation, phosphorylation, deamidation, O GlycNAcylation and SUMOylation throughout capsid proteins VP1, VP2 and VP3. These PTMs differ depending on the manufacturing production platform. Another such discovery is the fact that AAV genomes are epigenetically methylated during production. Besides price, these findings might affect expression kinetics, rAAV receptor binding, trafficking, vector immunogenicity, and expression durability.
Синтетикалық серотиптер
Клиникалық және ғылыми зерттеу мақсаттары үшін жаңа ААВ түрлерін жасау және жетілдіру үшін көптеген күш-жігер жұмсалды. Мұндай өзгерістерге белгілі бір тіндерді нысанаға алу үшін жаңа тропизмдер және иммундық жүйенің анықтауынан қашу үшін өзгертілген беткі қалдықтар кіреді. Белгілі бір жасушаларды нысанаға алу үшін рекомбинантты ААВ (rAAV) штаммдарын таңдаудан өзге, зерттеушілер ААВ псевдотипін де зерттеді – бұл белгілі бір ААВ штаммдарының будандарын жасау арқылы одан да нақты нысанаға қол жеткізу тәжірибесі. Гибридтің жасалуы бір штамнан капсидті, ал екінші штамнан геномды алу арқылы жүзеге асырылады. Мысалы, AAV2 геномдық және AAV5 капсиді бар гибрид – AAV2/5 зерттеуі, AAV2 гибридсіз қарағанда ми жасушаларында жоғары дәлдік пен кең ауқымға қол жеткізді. Зерттеушілер гибридті капсидтермен жаңа штаммдар құру арқылы псевдотиптеумен тәжірибелерін жалғастырды. AAV DJ сегіз түрлі ААВ штаммының гибридті капсидін қамтиды; осының арқасында ол дененің көптеген аймақтарындағы әртүрлі жасушаларды жұқтыра алады, бұл шектеулі тропизмге ие ААВ-дің бір штаммында болмайтын қасиет. Жаңа ААВ түрлерін жасау және жақсартуға бағытталған басқа да күш-жігерлерге вирустың ата-тегін қалпына келтіру арқылы клиникалық қолдану үшін және ААВ биологиясын зерттеу үшін жаңа қасиеттері бар векторларды жасау кіреді.
There have been many efforts to engineer and improve new AAV variants for both clinical and research purposes. Such modifications include new tropisms to target specific tissues, and modified surface residues to evade detection by the immune system. Beyond opting for particular strains of recombinant AAV (rAAV) to target particular cells, researchers have also explored AAV pseudotyping, the practice of creating hybrids of certain AAV strains to approach an even more refined target. The hybrid is created by taking a capsid from one strain and the genome from another strain. For example, research involving AAV2/5, a hybrid with the genome of AAV2 and the capsid of AAV5, was able to achieve more accuracy and range in brain cells than AAV2 would be able to achieve unhybridized. Researchers have continued to experiment with pseudotyping by creating strains with hybrid capsids. AAV DJ has a hybrid capsid from eight different strains of AAV; as such, it can infect different cells throughout many areas of the body, a property which a single strain of AAV with a limited tropism would not have. Other efforts to engineer and improve new AAV variants have involved the ancestral reconstruction of virus variants to generate new vectors with enhanced properties for clinical applications and the study of AAV biology.
Иммунология
ААВ гендік терапевтер үшін ерекше қызығушылық тудырады, себебі адамдарда иммундық жауаптарды тудыру қабілеті шектеулі болып көрінеді. Бұл фактор векторлық трандукция тиімділігін жақсартады және иммундық байланысты патология қаупін азайтуға мүмкіндік береді. ААВ ешқандай аурудың себебі деп есептелмейді. Дегенмен, ағзаның иммундық жүйесінің реакциясы және иммундық төзімділік ААВ арқылы жүзеге асырылатын гендік терапияның тиімділігін төмендетеді. Ағзаның иммундық жүйесі ААВ векторларына, трансдукцияланған жасушаларға және трансдукцияланған белоктарға жауап беретіні көрсетілген. Иммундық жауап екі түрге бөлінеді: туа біткен және адаптивті, соңғысы гуморальдық және жасушалық медиацияланған болып тармақталады.
AAV is of particular interest to gene therapists due to its apparent limited capacity to induce immune responses in humans, a factor which should positively influence vector transduction efficiency while reducing the risk of any immune associated pathology. AAV is not considered to have any known role in disease. However, host immune system response and immune tolerance reduce the efficacy of AAV mediated gene therapy. Host immune response has been shown to respond to the AAV vectors, the transduced cells, and the transduced proteins. The immune response can be subdivided into two categories: innate and adaptive, the latter of which is divided into humoral and cell mediated.
Тума бойымен
AAV векторларына туа біткен иммундық жауап жануарлар модельдерінде зерттелген. Тышқандарға тамырға енгізу (интравенозды түрде салу) қабынуға қарсы цитокиндердің уақытша өндірілуіне және нейтрофилдер мен басқа лейкоциттердің бауырға енуіне себеп болады, бұл инъекцияланған вирус бөлшектерінің көп бөлігін тоқтатады. Ерітінді факторлар деңгейі де, жасушалардың енуі де алты сағат ішінде бастапқы деңгейге оралады. Керісінше, күштірек вирустар 24 сағат немесе одан ұзаққа созылатын туа біткен иммундық жауапты тудырады. In vivo зерттеулер AAV векторларының Toll-қатысты рецепторлар (TLR) 9 және TLR2 MyD88 жолдарымен өзара әрекеттесіп, интерферон өндірісін стимуляциялау арқылы туа біткен иммундық жауапты қозғауын көрсетеді. TLR9 жетіспейтін тышқандар AAV емге жақсырақ жауап береді және трансген экспрессиясының жоғары деңгейін көрсетеді.
The innate immune response to the AAV vectors has been characterised in animal models. Intravenous administration in mice causes transient production of pro inflammatory cytokines and some infiltration of neutrophils and other leukocytes into the liver, which seems to sequester a large percentage of the injected viral particles. Both soluble factor levels and cell infiltration appear to return to baseline within six hours. By contrast, more aggressive viruses produce innate responses lasting 24 hours or longer. In vivo studies indicate that AAV vectors interact with the Toll like receptor (TLR)9 and TLR2 MyD88 pathways to trigger the innate immune response by stimulating the production of interferons. It's shown that mice deficient in TLR9 are more receptive to AAV treatment and demonstrate higher levels of transgene expression
Құмарлық
Бұрынғы табиғи инфекцияға байланысты көптеген адамдарда ААВ-ға қарсы бейтараптандыратын антиденелер (НАБ) болады, бұл гендік терапияда қолдануды айтарлықтай қиындатады. ААВ түрлері жабайы және синтетикалық варианттары арасында кең ауқымда өзгеше болғанымен, антиденелер танитын орындар эволюциялық тұрғыдан сақталған болуы мүмкін. Вирус жануарлар моделінде де, адамдар арасында да күшті гуморальды иммунитетті тудырады, онда шамамен 80% адам AAV2-ге серопозитивті болып табылады. Антиденелердің бейтараптандыру қабілеті белгілі, және гендік терапияда олар әртүрлі енгізу жолдары арқылы векторлық трансдукция тиімділігіне әсер етеді. ААВ-ға тән антиденелердің тұрақты деңгейімен қатар, жануарлардағы алдын ала күшейту зерттеулерінен және клиникалық сынақтардан В-жасушаларының жад қабілеті де жоғары екені көрінеді. Серопозитивті адамдардағы ААВ2-ге қарсы IgG антиденелері негізінен IgG1 және IgG2 субклассларын құрайды, ал IgG3 немесе IgG4 өте аз немесе мүлдем жоқ. CD8+ Т-жасушаларының ААВ капсидінің элементтерін *in vitro* жағдайында тани алатыны көрсетілгендіктен, ААВ векторларына цитотоксикалық Т-лимфоциттердің реакциясы болуы мүмкін. Цитотоксикалық реакциялар CD4+ Т-көмекші жасушаларының ААВ-қа реакцияға қатысқанын білдіреді, ал адамдардағы зерттеулерден алынған *in vitro* деректер вирустың осындай реакцияларды, соның ішінде Th1 және Th2 жад реакцияларын тудыруы мүмкін екенін көрсетеді. ААВ капсидінің VP1 ақуызында Т-жасушаларын стимуляциялайтын бірнеше кандидатты эпитоптар анықталды, егер вирус гендік терапия үшін вектор ретінде қолданылса, олар капсидті модификациялау үшін тартымды нысаналар болуы мүмкін. Адено-ассоцияланған вирустың ерекшелігі – репликацияның жетіспеушілігі, демек, зақымдалмаған жасушаларда көбейе алмауы. Адено-ассоцияланған вирус жасушаны көмекші вируспен бірге жұқтыру арқылы таралады. Жаңа ААВ бөлшектерін табысты өндіруге қабілетті алғашқы көмекші вирус аденовирус болды, осыдан ААВ атауы шыққан. Кейін ААВ репликациясын аденовирус геномынан алынған белгілі бір белоктар, басқа вирустар (мысалы, HSV немесе вакциния) немесе генотоксикалық факторлар (мысалы, ультракөк сәулелендіру немесе гидроксимочевина) жеделдетуі мүмкін екені көрсетілді. Көмекші вирус бар немесе жоқ болуына байланысты ААВ-ның өмірлік циклі тиісінше литикалық немесе лизогендік жолмен жүреді. Егер көмекші вирус болса, ААВ гендерінің экспрессиясы белсендіріледі, бұл вирусқа жасушаның полимеразасын пайдаланып көбейуге мүмкіндік береді. Көмекші вирус жасушаны өлтірген кезде жаңа ААВ вириондары босатылады. Егер көмекші вирус болмаса, ААВ лизогенді мінез-құлық көрсетеді. ААВ жасушаны жеке жұқтырғанда, оның гендік экспрессиясы басылады (ААВ көбеймейді), ал оның геномы жасуша геномына (адамның 19-хромосомасына) енгізіледі. Сирек жағдайларда лизис көмекші вируссыз да жүруі мүмкін, бірақ әдетте ААВ жасушаны өздігінен көбейтіп өлтіре алмайды. ААВ ұрпақтарын тиімді өндіру үшін қажетті аденовирустық гендердің минималды жиынтығын Мацушита, Эллингер және басқалар анықтады.
Due to previous natural infection, many people have preexisting neutralizing antibodies (NAbs) against AAV's, which can significantly hinder its application in gene therapy. Even though AAV's are highly variable among wild type and synthetic variants, antibody recognition sites may be conserved evolutionarily. The virus is known to instigate robust humoral immunity in animal models and in the human population, where up to 80% of individuals are thought to be seropositive for AAV2. Antibodies are known to be neutralising, and for gene therapy applications these do impact vector transduction efficiency via some routes of administration. As well as persistent AAV specific antibody levels, it appears from both prime boost studies in animals and from clinical trials that the B cell memory is also strong. In seropositive humans, circulating IgG antibodies for AAV2 appear to be primarily composed of the IgG1 and IgG2 subclasses, with little or no IgG3 or IgG4 present. Combined with data that shows that CD8+ T cells can recognise elements of the AAV capsid in vitro, it appears that there may be a cytotoxic T lymphocyte response to AAV vectors. Cytotoxic responses would imply the involvement of CD4+ T helper cells in the response to AAV and in vitro data from human studies suggests that the virus may indeed induce such responses, including both Th1 and Th2 memory responses. A number of candidate T cell stimulating epitopes have been identified within the AAV capsid protein VP1, which may be attractive targets for modification of the capsid if the virus is to be used as a vector for gene therapy. The characteristic feature of the adeno associated virus is a deficiency in replication and thus its inability to multiply in unaffected cells. Adeno associated virus spreads by co infecting a cell with a helper virus. The first helper virus that was described as providing successful generation of new AAV particles, was the adenovirus, from which the AAV name originated. It was then shown that AAV replication can be facilitated by selected proteins derived from the adenovirus genome, by other viruses such as HSV or vaccinia, or by genotoxic agents, such as UV irradiation or hydroxyurea. Depending on the presence or absence of a helper virus, the life cycle of AAV follows either a lytic or lysogenic pathway, respectively. If there is a helper virus, AAV's gene expression activates, allowing the virus to replicate using the host cell's polymerase. When the helper virus kills the host cell, the new AAV virions are released. If there is not a helper virus present, AAV exhibits lysogenic behavior. When AAV infects a cell alone, its gene expression is repressed (AAV does not replicate), and its genome is incorporated into the host genome (into human chromosome 19). In rare cases, lysis can occur without a helper virus, but usually AAV can not replicate and kill a cell on its own. The minimal set of the adenoviral genes required for efficient generation, of progeny AAV particles, was discovered by Matsushita, Ellinger et al.