Аденоассоциированные вирусы: характеристики и применение в генной терапии.

Введение

Виды вирусов

Аденоассоциированные вирусы (AAV) – это небольшие вирусы, инфицирующие людей и некоторые другие виды приматов. Они относятся к роду Dependoparvovirus, который, в свою очередь, входит в семейство Parvoviridae. Это небольшие (около 26 нм в диаметре) репликационно-дефектные, не имеющие оболочки вирусы с линейным одноцепочечным ДНК (ssDNA) геномом размером примерно 4,8 килобазы (kb). Ряд особенностей делают AAV привлекательным кандидатом для создания вирусных векторов для генной терапии и моделей изогенных заболеваний человека. Векторы генной терапии на основе AAV способны инфицировать как делящиеся, так и не делящиеся клетки и сохраняться в экстрахромосомном состоянии, не интегрируясь в геном клетки-хозяина. Однако в естественном вирусе интеграция переносимых вирусом генов в геном хозяина все же происходит. Интеграция может быть важна для определенных применений, но также может иметь нежелательные последствия. Недавние клинические испытания на людях с использованием AAV для генной терапии сетчатки показали обнадеживающие результаты. В марте 2023 года в серии публикаций в журнале Nature были обнаружены высокие титры аденоассоциированного вируса 2 (AAV2) в образцах, взятых у пациентов с волной детского гепатита, наряду с аденовирусом и герпесвирусом. В одной из статей предполагается, что коинфекция AAV2 может способствовать развитию более тяжелого заболевания печени, чем инфекция только аденовирусами или герпесвирусами, и что причинно-следственная связь требует дальнейшего изучения.

История

Аденоассоциированный вирус (ААВ), который ранее считался загрязнителем в препаратах аденовируса, был впервые идентифицирован как депендопарвовирус в 1960-х годах в лабораториях Боба Атчисона в Питтсбурге и Уоллеса Роу в NIH. Последующие серологические исследования на людях показали, что, несмотря на обнаружение у людей, инфицированных вспомогательными вирусами, такими как аденовирус или вирус герпеса, сам ААВ не вызывал никаких заболеваний.

Преимущества и недостатки

Дикий тип ААВ привлек значительный интерес исследователей генной терапии благодаря ряду особенностей. Главной из них было кажущееся отсутствие патогенности вируса. Он также способен инфицировать не делящиеся клетки и обладает способностью стабильно интегрироваться в геном клетки-хозяина в определенном участке (обозначенном AAVS1) в 19-й хромосоме человека. Эта особенность делает его несколько более предсказуемым, чем ретровирусы, которые несут угрозу случайной интеграции и мутагенеза, иногда приводящего к развитию рака. Геном ААВ чаще всего интегрируется в указанный участок, в то время как случайные включения в геном происходят с пренебрежимо малой частотой. Однако, разработка ААВ в качестве векторов генной терапии устранила эту интегративную способность путем удаления генов *rep* и *cap* из ДНК вектора. Желаемый ген вместе с промотором, обеспечивающим транскрипцию гена, вставляется между инвертированными терминальными повторами (ITR), которые способствуют образованию конкатемеров в ядре после того, как одноцепочечная векторная ДНК преобразуется комплексами ДНК-полимеразы клетки-хозяина в двухцепочечную ДНК. Векторы генной терапии на основе ААВ формируют эпизомальные конкатемеры в ядре клетки-хозяина. В не делящихся клетках эти конкатемеры остаются неповрежденными на протяжении всей жизни клетки-хозяина. В делящихся клетках ДНК ААВ теряется в процессе деления клеток, поскольку эпизомальная ДНК не реплицируется вместе с ДНК клетки-хозяина. Случайная интеграция ДНК ААВ в геном хозяина обнаруживается, но происходит с очень низкой частотой. Эта особенность, в сочетании со способностью инфицировать покоящиеся клетки, обеспечивает его превосходство над аденовирусами в качестве векторов для генной терапии человека. Использование вируса, однако, имеет некоторые недостатки. Емкость вектора для клонирования относительно ограничена, и для большинства терапевтических генов требуется полная замена 4,8-килобазного генома вируса. Следовательно, большие гены не подходят для использования в стандартном векторе ААВ. В настоящее время изучаются способы преодоления ограниченной кодирующей способности. ITR двух геномов ААВ могут аннелировать, образуя конкатемеры типа "голова к хвосту", почти удваивая емкость вектора. Вставка сайтов сплайсинга позволяет удалить ITR из транскрипта. Благодаря специализированным преимуществам ААВ в генной терапии, исследователи создали модифицированную версию ААВ, названную самокомплементарным аденоассоциированным вирусом (scAAV). В то время как ААВ упаковывает одну цепь ДНК и должен ждать синтеза второй цепи, scAAV упаковывает две более короткие цепи, комплементарные друг другу. Избегая синтеза второй цепи, scAAV может экспрессироваться быстрее, однако, как ограничение, scAAV может кодировать только половину и без того ограниченной емкости ААВ. Недавние сообщения указывают на то, что векторы scAAV более иммуногенны, чем одноцепочечные аденовирусные векторы, вызывая более сильную активацию цитотоксических Т-лимфоцитов. Гуморальный иммунитет, индуцированный инфекцией диким типом, считается распространенным явлением. Связанная с этим нейтрализующая активность ограничивает полезность наиболее часто используемого серотипа AAV2 в определенных областях применения. Соответственно, большинство текущих клинических испытаний включают доставку AAV2 в мозг – относительно иммунологически привилегированный орган. В мозге AAV2 обладает высокой нейрон-специфичностью.

Wild type AAV has attracted considerable interest from gene therapy researchers due to a number of features. Chief amongst these was the virus's apparent lack of pathogenicity. It can also infect non dividing cells and has the ability to stably integrate into the host cell genome at a specific site (designated AAVS1) in the human chromosome 19. This feature makes it somewhat more predictable than retroviruses, which present the threat of a random insertion and of mutagenesis, which is sometimes followed by development of a cancer. The AAV genome integrates most frequently into the site mentioned, while random incorporations into the genome take place with a negligible frequency. Development of AAVs as gene therapy vectors, however, has eliminated this integrative capacity by removal of the rep and cap from the DNA of the vector. The desired gene together with a promoter to drive transcription of the gene is inserted between the inverted terminal repeats (ITRs) that aid in concatemer formation in the nucleus after the single stranded vector DNA is converted by host cell DNA polymerase complexes into double stranded DNA. AAV based gene therapy vectors form episomal concatemers in the host cell nucleus. In non dividing cells, these concatemers remain intact for the life of the host cell. In dividing cells, AAV DNA is lost through cell division, since the episomal DNA is not replicated along with the host cell DNA. Random integration of AAV DNA into the host genome is detectable but occurs at very low frequency. This feature, along with the ability to infect quiescent cells present their dominance over adenoviruses as vectors for human gene therapy. Use of the virus does present some disadvantages. The cloning capacity of the vector is relatively limited and most therapeutic genes require the complete replacement of the virus's 4.8 kilobase genome. Large genes are, therefore, not suitable for use in a standard AAV vector. Options are currently being explored to overcome the limited coding capacity. The AAV ITRs of two genomes can anneal to form head to tail concatemers, almost doubling the capacity of the vector. Insertion of splice sites allows for the removal of the ITRs from the transcript. Because of AAV's specialized gene therapy advantages, researchers have created an altered version of AAV termed self complementary adeno associated virus (scAAV). Whereas AAV packages a single strand of DNA and must wait for its second strand to be synthesized, scAAV packages two shorter strands that are complementary to each other. By avoiding second strand synthesis, scAAV can express more quickly, although as a caveat, scAAV can only encode half of the already limited capacity of AAV. Recent reports suggest that scAAV vectors are more immunogenic than single stranded adenovirus vectors, inducing a stronger activation of cytotoxic T lymphocytes. Humoral immunity instigated by infection with the wild type is thought to be common. The associated neutralising activity limits the usefulness of the most commonly used serotype AAV2 in certain applications. Accordingly, the majority of clinical trials under way involve delivery of AAV2 into the brain, a relatively immunologically privileged organ. In the brain, AAV2 is strongly neuron specific.

Геномная, транскриптомическая и протеомическая

Геном AAV построен из одноцепочечной дезоксирибонуклеиновой кислоты (ssDNA), ориентированной либо в положительном, либо в отрицательном направлении, длиной около 4,7 килобазы. Геном включает в себя инвертированные концевые повторы (ITR) на обоих концах цепи ДНК, а также две открытые рамки считывания (ORF): rep и cap. Первая состоит из четырех перекрывающихся генов, кодирующих белки Rep, необходимые для жизненного цикла AAV, а вторая содержит перекрывающиеся нуклеотидные последовательности белков капсида: VP1, VP2 и VP3, которые взаимодействуют друг с другом, формируя капсид с икосаэдрической симметрией.

Последовательность ITR

Каждая из перевернутых повторов концевых последовательностей (ITR) состоит из 145 нуклеотидов. Они получили такое название из-за своей симметрии, которая, как было показано, необходима для эффективной репликации генома AAV. Свойством этих последовательностей, обеспечивающим это, является их способность образовывать шпильку, что способствует так называемому самоинициированию, позволяющему синтезировать вторую цепь ДНК без участия примазы. Также было показано, что ITR необходимы как для интеграции ДНК AAV в геном клетки-хозяина (19-я хромосома у человека), так и для ее высвобождения, а также для эффективного инкапсидирования ДНК AAV в сочетании с образованием полностью собранных частиц AAV, устойчивых к дезоксирибонуклеазе. В контексте генной терапии, ITR, по-видимому, являются единственными последовательностями, необходимыми в цис рядом с терапевтическим геном: структурные (кап) и упаковочные (реп) белки могут быть доставлены в транс. Исходя из этого предположения, было разработано множество методов эффективного производства рекомбинантных векторов AAV (rAAV), содержащих репортерный или терапевтический ген. Однако также было опубликовано, что ITR – не единственные элементы, необходимые в цис для эффективной репликации и инкапсидации. Несколько исследовательских групп идентифицировали последовательность, обозначенную как цис-действующий реп-зависимый элемент (CARE), внутри кодирующей последовательности гена rep. Было показано, что CARE усиливает репликацию и инкапсидацию при наличии в цис.

гены реп и белки реп

На "левой стороне" генома расположены два промотора, p5 и p19, с которых могут быть получены две перекрывающиеся мессенджерные рибонуклеиновые кислоты (мРНК) различной длины. Каждая из них содержит интрон, который может быть как удален в процессе сплайсинга, так и сохранен. Учитывая эти возможности, могут быть синтезированы четыре различных мРНК, а следовательно, и четыре различных белка Rep с перекрывающимися последовательностями. Их названия отражают их размеры в килодальтонах (кДа): Rep78, Rep68, Rep52 и Rep40. Rep78 и Rep68 способны специфически связываться с "шпилькой", образованной ITR, в процессе самоинициирования и расщеплять ДНК в определенной области, обозначенной как сайт терминального разрешения, внутри этой "шпильки". Также было показано, что они необходимы для специфической интеграции генома ААV в локус AAVS1. Все четыре белка Rep связывают АТФ и обладают геликазной активностью. Кроме того, было показано, что они усиливают транскрипцию с промотора p40 (упомянутого ниже), но подавляют транскрипцию с промоторов p5 и p19.

ген капе и белки VP

Правая сторона генома ААВ с положительной сенсорностью кодирует перекрывающиеся последовательности трех капсидных белков – VP1, VP2 и VP3, а также двух дополнительных белков – MAAP и AAP, которые инициируются с одного промотора, обозначенного p40. Молекулярные массы этих белков составляют 87, 72 и 62 килодальтона соответственно. Капсид ААВ состоит из смеси VP1, VP2 и VP3, в общей сложности 60 мономеров, расположенных в икосаэдрической симметрии в соотношении 1:1:10, при этом пустая масса составляет приблизительно 3,8 MDa. Кристаллическая структура белка VP3 была определена Xie, Bue и соавторами. Ген cap кодирует дополнительный неструктурный белок, называемый белком активации сборки (AAP). Этот белок образуется из ORF2 и необходим для процесса сборки капсидов. Точная функция этого белка в процессе сборки и его структура до сих пор не установлены. Все три VP транслируются из одной мРНК. После синтеза этой мРНК она может подвергаться сплайсингу двумя различными способами: может вырезаться более длинный или более короткий интрон, что приводит к образованию двух пулов мРНК: пула мРНК длиной 2,3 кб и пула мРНК длиной 2,6 кб. Обычно, особенно в присутствии аденовируса, предпочтение отдается более длинному интрону, поэтому мРНК длиной 2,3 кб представляет собой так называемый "основной сплайс-вариант". В этой форме первый кодон AUG, с которого начинается синтез белка VP1, вырезается, что приводит к снижению общего уровня синтеза белка VP1. Первый кодон AUG, который остается в основном сплайс-варианте, является кодоном инициации для белка VP3. Однако выше по течению от этого кодона в той же открытой рамке чтения находится последовательность ACG (кодирующая треонин), окруженная оптимальным контекстом Козака. Это способствует низкому уровню синтеза белка VP2, который, как и VP1, фактически является белком VP3 с дополнительными N-концевыми остатками. Поскольку предпочтительно вырезание более крупного интрона, а в основном сплайс-варианте кодон ACG является гораздо более слабым сигналом инициации трансляции, соотношение, при котором структурные белки ААВ синтезируются in vivo, составляет примерно 1:1:20, что соответствует соотношению в зрелой вирусной частице. Уникальный фрагмент на N-конце белка VP1 обладает активностью фосфолипазы A2 (PLA2), которая, вероятно, необходима для высвобождения частиц ААВ из поздних эндосом. Муралидхар и соавторы сообщили, что VP2 и VP3 имеют решающее значение для правильной сборки вириона.

The right side of a positive sensed AAV genome encodes overlapping sequences of three capsid proteins, VP1, VP2 and VP3, and two accessory proteins, MAAP & AAP, which start from one promoter, designated p40. The molecular weights of these proteins are 87, 72 and 62 kiloDaltons, respectively. The AAV capsid is composed of a mixture of VP1, VP2, and VP3 totaling 60 monomers arranged in icosahedral symmetry in a ratio of 1:1:10, with an empty mass of approximately 3.8 MDa. The crystal structure of the VP3 protein was determined by Xie, Bue, et al. The cap gene produces an additional, non structural protein called the Assembly Activating Protein (AAP). This protein is produced from ORF2 and is essential for the capsid assembly process. The exact function of this protein in the assembly process and its structure have not been solved to date. All three VPs are translated from one mRNA. After this mRNA is synthesized, it can be spliced in two different manners: either a longer or shorter intron can be excised resulting in the formation of two pools of mRNAs: a 2.3 kb and a 2.6 kb long mRNA pool. Usually, especially in the presence of adenovirus, the longer intron is preferred, so the 2.3 kb long mRNA represents the so called "major splice". In this form the first AUG codon, from which the synthesis of VP1 protein starts, is cut out, resulting in a reduced overall level of VP1 protein synthesis. The first AUG codon that remains in the major splice is the initiation codon for VP3 protein. However, upstream of that codon in the same open reading frame lies an ACG sequence (encoding threonine) which is surrounded by an optimal Kozak context. This contributes to a low level of synthesis of VP2 protein, which is actually VP3 protein with additional N terminal residues, as is VP1. Since the bigger intron is preferred to be spliced out, and since in the major splice the ACG codon is a much weaker translation initiation signal, the ratio at which the AAV structural proteins are synthesized in vivo is about 1:1:20, which is the same as in the mature virus particle. The unique fragment at the N terminus of VP1 protein was shown to possess the phospholipase A2 (PLA2) activity, which is probably required for the releasing of AAV particles from late endosomes. Muralidhar et al. reported that VP2 and VP3 are crucial for correct virion assembly.

Постпереводные изменения

Недавние открытия, полученные с помощью высокопроизводительных "омиксных подходов, показали, что AAV-капсиды подвергаются посттрансляционным модификациям (PTM) в процессе производства, включая ацетилирование, метилирование, фосфорилирование, деамидирование, O-глюкозилирование и SUMOилирование белков VP1, VP2 и VP3. Эти ПТМ варьируются в зависимости от используемой производственной платформы. Также было обнаружено, что геномы AAV эпигенетически метилируются во время производства. Помимо стоимости, эти факторы могут влиять на кинетику экспрессии, связывание rAAV с рецепторами, транспорт вектора, его иммуногенность и продолжительность экспрессии.

Синтетические серотипы

Было предпринято множество попыток разработки и улучшения новых вариантов ААВ как для клинических, так и для исследовательских целей. Эти модификации включают в себя новые тропизмы для нацеливания на определенные ткани и модифицированные поверхностные остатки для избежания обнаружения иммунной системой. Помимо выбора конкретных штаммов рекомбинантного ААВ (rAAV) для нацеливания на определенные клетки, исследователи также изучали псевдотипирование ААВ – практику создания гибридов определенных штаммов ААВ для достижения еще более точного таргетинга. Гибрид создается путем использования капсида одного штамма и генома другого. Например, исследование, посвященное AAV2/5, гибриду с геномом AAV2 и капсидом AAV5, позволило достичь большей точности и охвата в отношении клеток мозга, чем это было бы возможно для негибридизированного AAV2. Исследователи продолжают экспериментировать с псевдотипированием, создавая штаммы с гибридными капсидами. AAV DJ обладает гибридным капсидом, состоящим из восьми различных штаммов ААВ; благодаря этому он способен инфицировать различные клетки во многих областях тела, что невозможно для отдельного штамма ААВ с ограниченным тропизмом. Другие усилия по разработке и улучшению новых вариантов ААВ включали в себя реконструкцию предковых вариантов вируса для создания новых векторов с улучшенными свойствами для клинического применения и изучения биологии ААВ.

Иммунология

ААВ представляет особый интерес для специалистов по генной терапии благодаря его кажущейся ограниченной способности вызывать иммунные ответы у человека, что должно положительно влиять на эффективность трансдукции вектора и снижать риск иммунопатологии. Не считается, что ААВ играет какую-либо известную роль в развитии заболеваний. Однако, реакция иммунной системы организма-хозяина и иммунная толерантность снижают эффективность генной терапии, опосредованной ААВ. Показано, что иммунный ответ организма-хозяина реагирует на ААВ-векторы, трансдуцированные клетки и экспрессируемые белки. Иммунный ответ можно разделить на две категории: врожденный и адаптивный, причем последний подразделяется на гуморальный и клеточный.

Врожденный

Врожденный иммунный ответ на AAV-векторы был охарактеризован на животных моделях. Внутривенное введение мышам вызывает кратковременную продукцию провоспалительных цитокинов и некоторую инфильтрацию нейтрофилов и других лейкоцитов в печень, что приводит к секвестрации значительной части введенных вирусных частиц. Уровни растворимых факторов и клеточная инфильтрация возвращаются к исходному уровню в течение шести часов. В то же время, более агрессивные вирусы вызывают врожденные иммунные ответы, продолжающиеся 24 часа и более. In vivo исследования показывают, что AAV-векторы взаимодействуют с TLR9 и TLR2/MyD88 путями, активируя врожденный иммунный ответ посредством стимуляции продукции интерферонов. Показано, что мыши с дефицитом TLR9 более восприимчивы к терапии AAV и демонстрируют более высокие уровни экспрессии трансгена.

Юмористический

Из-за предшествующей естественной инфекции у многих людей уже имеются преэксистирующие нейтрализующие антитела (НАБ) к ААВ, что может существенно затруднить его применение в генной терапии. Несмотря на высокую вариабельность ААВ среди диких и синтетических вариантов, эпитопы распознавания антител могут эволюционно сохраняться. Известно, что вирус вызывает выраженный гуморальный иммунитет в моделях на животных и в популяции людей, где, по оценкам, до 80% индивидуумов серопозитивны по AAV2. Антитела обладают нейтрализующей активностью, и в контексте генной терапии они влияют на эффективность трансдукции вектора при некоторых путях введения. Помимо стойких уровней ААВ-специфических антител, как исследования на животных, так и клинические испытания указывают на наличие сильной памяти В-клеток. У серопозитивных людей циркулирующие антитела IgG к AAV2 преимущественно представлены подклассами IgG1 и IgG2, при незначительном или полном отсутствии IgG3 и IgG4. В сочетании с данными о том, что CD8+ Т-клетки способны распознавать элементы капсида ААВ in vitro, можно предположить наличие цитотоксического Т-лимфоцитарного ответа на векторы ААВ. Цитотоксические ответы подразумевают участие CD4+ Т-хелперов в иммунном ответе на ААВ, и данные in vitro, полученные в исследованиях на людях, свидетельствуют о том, что вирус действительно может индуцировать такие ответы, включая как Th1, так и Th2 ответы памяти. В белке капсида ААВ VP1 идентифицирован ряд потенциальных Т-клеточных эпитопов, которые могут быть привлекательными мишенями для модификации капсида, если вирус будет использоваться в качестве вектора для генной терапии. Характерной особенностью аденоассоциированного вируса является дефект репликации и, следовательно, его неспособность к размножению в неинфицированных клетках. Аденоассоциированный вирус распространяется путем коинфицирования клетки с вспомогательным вирусом. Первым вспомогательным вирусом, показавшим способность обеспечивать эффективное создание новых частиц ААВ, был аденовирус, от которого и произошло название ААВ. Впоследствии было продемонстрировано, что репликация ААВ может быть облегчена определенными белками, происходящими из генома аденовируса, другими вирусами, такими как HSV или вакциния, или генотоксическими агентами, такими как УФ-излучение или гидроксимочевина. В зависимости от наличия или отсутствия вспомогательного вируса жизненный цикл ААВ следует либо литическому, либо лизогенному пути. При наличии вспомогательного вируса активируется экспрессия генов ААВ, что позволяет вирусу реплицироваться с использованием полимеразы клетки-хозяина. Когда вспомогательный вирус вызывает гибель клетки-хозяина, высвобождаются новые вирионы ААВ. В отсутствие вспомогательного вируса ААВ проявляет лизогенное поведение: экспрессия его генов подавляется (ААВ не реплицируется), а его геном интегрируется в геном клетки-хозяина (в 19-ю хромосому человека). В редких случаях лизис может происходить без вспомогательного вируса, но обычно ААВ не способен самостоятельно реплицироваться и вызывать гибель клетки. Минимальный набор генов аденовируса, необходимых для эффективной генерации вирусного потомства ААВ, был установлен Мацуситой, Эллингером и соавторами.

Due to previous natural infection, many people have preexisting neutralizing antibodies (NAbs) against AAV's, which can significantly hinder its application in gene therapy. Even though AAV's are highly variable among wild type and synthetic variants, antibody recognition sites may be conserved evolutionarily. The virus is known to instigate robust humoral immunity in animal models and in the human population, where up to 80% of individuals are thought to be seropositive for AAV2. Antibodies are known to be neutralising, and for gene therapy applications these do impact vector transduction efficiency via some routes of administration. As well as persistent AAV specific antibody levels, it appears from both prime boost studies in animals and from clinical trials that the B cell memory is also strong. In seropositive humans, circulating IgG antibodies for AAV2 appear to be primarily composed of the IgG1 and IgG2 subclasses, with little or no IgG3 or IgG4 present. Combined with data that shows that CD8+ T cells can recognise elements of the AAV capsid in vitro, it appears that there may be a cytotoxic T lymphocyte response to AAV vectors. Cytotoxic responses would imply the involvement of CD4+ T helper cells in the response to AAV and in vitro data from human studies suggests that the virus may indeed induce such responses, including both Th1 and Th2 memory responses. A number of candidate T cell stimulating epitopes have been identified within the AAV capsid protein VP1, which may be attractive targets for modification of the capsid if the virus is to be used as a vector for gene therapy. The characteristic feature of the adeno associated virus is a deficiency in replication and thus its inability to multiply in unaffected cells. Adeno associated virus spreads by co infecting a cell with a helper virus. The first helper virus that was described as providing successful generation of new AAV particles, was the adenovirus, from which the AAV name originated. It was then shown that AAV replication can be facilitated by selected proteins derived from the adenovirus genome, by other viruses such as HSV or vaccinia, or by genotoxic agents, such as UV irradiation or hydroxyurea. Depending on the presence or absence of a helper virus, the life cycle of AAV follows either a lytic or lysogenic pathway, respectively. If there is a helper virus, AAV's gene expression activates, allowing the virus to replicate using the host cell's polymerase. When the helper virus kills the host cell, the new AAV virions are released. If there is not a helper virus present, AAV exhibits lysogenic behavior. When AAV infects a cell alone, its gene expression is repressed (AAV does not replicate), and its genome is incorporated into the host genome (into human chromosome 19). In rare cases, lysis can occur without a helper virus, but usually AAV can not replicate and kill a cell on its own. The minimal set of the adenoviral genes required for efficient generation, of progeny AAV particles, was discovered by Matsushita, Ellinger et al.