Ағылшыншамен салыстырыңыз: абзацты басыңыз — түпнұсқа терезеде ашылады. Абзац астындағы EN түймесі оны мәтін ішінде көрсетеді.
Мазмұны
Кіріспе
Айырмалы гельдік электрофорез (DIGE) – гельдік электрофорездің бір түрі, онда екі өлшемді гельдік электрофорезден бұрын үш түрлі белок үлгісі өлшемі мен заряды сәйкес келетін, спектрлік тұрғыдан ажыратылатын флуоресцентті бояулармен (мысалы, Cy3, Cy5, Cy2) белгіленеді.
Difference gel electrophoresis (DIGE) is a form of gel electrophoresis where up to three different protein samples can be labeled with size matched, charge matched spectrally resolvable fluorescent dyes (for example Cy3, Cy5, Cy2) prior to two dimensional gel electrophoresis.
Процедура
Үш үлгі араластырылып, бірінші өлшем үшін IEF (изоэлектрлік фокустық хроматография) құрылғысына салынады және таспа SDS PAGE-ге көшіріледі. Гель электрофорезінен кейін гель әр бояудың қоздыру толқын ұзындығымен бірінен соң бірі сканерленеді, сондықтан әрбір үлгі бөлек көрінеді (мысалы, егер гельді Cy3 бояуының қоздыру толқын ұзындығында сканерлесек, гельде тек сол бояумен белгіленген үлгі ғана көрінеді). Бұл техника ақуыздың мөлшеріндегі өзгерістерді (мысалы, сау адамның және ауруы бар адамның үлгілері арасындағы айырмашылықтарды), трансляциядан кейінгі модификацияларды, ақуыздың қысқаруын және олардың мөлшеріне немесе изоэлектрлік нүктесіне әсер ететін кез келген өзгерістерді анықтау үшін қолданылады. Бинарлық өзгерістер солдан оңға (изоэлектрлік нүктедегі өзгеріс), тік (мөлшердегі өзгеріс) немесе диагональды (мөлшер мен изоэлектрлік нүктедегі өзгеріс) болуы мүмкін. Өзара таңбалау, байқалатын өзгерістердің бояуға тәуелді өзара әрекеттесулерден туындамағанын қамтамасыз ету үшін жасалады.
The three samples are mixed and loaded onto IEF (isoelectric focusing chromatography) for first dimension and the strip is transferred to a SDS PAGE. After the gel electrophoresis, the gel is scanned with the excitation wavelength of each dye one after the other, so each sample can be seen separately (if we scan the gel at the excitation wavelength of the Cy3 dye, we will see in the gel only the sample that was labeled with that dye). This technique is used to see changes in protein abundance (for example, between a sample of a healthy person and a sample of a person with disease), post translational modifications, truncations and any modification that might change the size or isoelectric point of proteins. The binary shifts might be left to right (change in isoelectric point), vertical (change in size) or diagonal (change in both size and isoelectric point). Reciprocal Labeling is done to make sure the changes seen are not due to dye dependent interactions.
Артықшылықтар
Ол интергельдік айырмашылықтарға байланысты дәстүрлі 2D электрофорезінің шектеулерін жолайды. Бұл тіпті бірдей сынамалар үшін де маңызды болуы мүмкін. Әртүрлі сынама түрлерінен (мысалы, сау/ауру, қауіпті/қауіпсіз) алынған ақуыздар бір гельде жүргізілгендіктен, оларды тікелей салыстыруға болады. Дәстүрлі 2D электрофорезбен мұны жасау үшін көп уақыт алатын көптеген қайталаулар қажет.
It overcomes limitations in traditional 2D electrophoresis that are due to inter gel variation. This can be considerable even with identical samples. Since the proteins from the different sample types (e. g. healthy/diseased, virulent/non virulent) are run on the same gel they can be directly compared. To do this with traditional 2D electrophoresis requires large numbers of time consuming repeats.
Стандарттар
Бірнеше гельді қамтитын эксперименттерде әрбір гельге ішкі стандарт қосу жиі қолданылатын тәсіл. Ішкі стандарт эксперименттегі бірнеше немесе барлық сынамаларды араластыру арқылы дайындалады. Бұл әрбір сынамадағы белок мөлшерін ішкі стандартқа шаққанда өлшеуге мүмкіндік береді. Ішкі стандарттағы әр белоктың мөлшері барлық гельдерде бірдей болғандықтан, бұл тәсіл гельдер арасындағы айырмашылықтарды азайтады.
In experiments comprising several gels, a common technique is to include an internal standard in each gel. The internal standard is prepared by mixing together several or all of the samples in the experiment. This allows the measurement of the abundance of a protein in each sample relative to the internal standard. Since the amounts of each protein in the internal standard is known to be the same in every gel, this method reduces inter gel variation.