Дифференциальный гель-электрофорез: обнаружение изменений в протеоме
Difference gel electrophoresis
DIGE: анализ изменений в протеоме. Метод гель-электрофореза для сравнения образцов, выявления модификаций белков и диагностики заболеваний. Протеомика.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Дифференциальный гелевый электрофорез (DIGE) – это разновидность гелевого электрофореза, при которой до трех различных образцов белка могут быть маркированы флуоресцентными красителями, подобранными по размеру и заряду и спектрально различимыми (например, Cy3, Cy5, Cy2), перед проведением двухмерного гелевого электрофореза.
Difference gel electrophoresis (DIGE) is a form of gel electrophoresis where up to three different protein samples can be labeled with size matched, charge matched spectrally resolvable fluorescent dyes (for example Cy3, Cy5, Cy2) prior to two dimensional gel electrophoresis.
Процедура
Три образца смешиваются и загружаются на ИЭФ (изоэлектрическое фокусирование) для первого измерения, а полоска переносится на SDS-PAGE. После электрофореза гель сканируется последовательно с длиной волны возбуждения каждого красителя, что позволяет визуализировать каждый образец отдельно (например, сканирование геля на длине волны возбуждения красителя Cy3 покажет только образец, помеченный этим красителем). Эта методика используется для выявления изменений в количестве белка (например, между образцом здорового человека и образцом человека с заболеванием), посттрансляционных модификаций, усечений и любых модификаций, способных изменить размер или изоэлектрическую точку белков. Сдвиги могут быть горизонтальными (изменение изоэлектрической точки), вертикальными (изменение размера) или диагональными (изменение как размера, так и изоэлектрической точки). Для исключения влияния взаимодействий, зависящих от красителя, проводится взаимная маркировка образцов.
The three samples are mixed and loaded onto IEF (isoelectric focusing chromatography) for first dimension and the strip is transferred to a SDS PAGE. After the gel electrophoresis, the gel is scanned with the excitation wavelength of each dye one after the other, so each sample can be seen separately (if we scan the gel at the excitation wavelength of the Cy3 dye, we will see in the gel only the sample that was labeled with that dye). This technique is used to see changes in protein abundance (for example, between a sample of a healthy person and a sample of a person with disease), post translational modifications, truncations and any modification that might change the size or isoelectric point of proteins. The binary shifts might be left to right (change in isoelectric point), vertical (change in size) or diagonal (change in both size and isoelectric point). Reciprocal Labeling is done to make sure the changes seen are not due to dye dependent interactions.
Преимущества
Он преодолевает ограничения традиционного 2D-электрофореза, связанные с межгелевыми различиями. Эти различия могут быть значительными даже при идентичных образцах. Поскольку белки из разных типов образцов (например, здоровых и больных, вирулентных и не вирулентных) разделяются на одном геле, их можно напрямую сравнивать. Для этого в традиционном 2D-электрофорезе требуются многочисленные и трудоемкие повторы.
It overcomes limitations in traditional 2D electrophoresis that are due to inter gel variation. This can be considerable even with identical samples. Since the proteins from the different sample types (e. g. healthy/diseased, virulent/non virulent) are run on the same gel they can be directly compared. To do this with traditional 2D electrophoresis requires large numbers of time consuming repeats.
Стандарты
В экспериментах, включающих несколько гелей, обычной практикой является добавление внутреннего стандарта в каждый гель. Внутренний стандарт готовится путем смешивания нескольких или всех образцов из эксперимента. Это позволяет измерять количество белка в каждом образце относительно внутреннего стандарта. Поскольку концентрация каждого белка во внутреннем стандарте известна и одинакова во всех гелях, этот метод снижает вариабельность между гелями.
In experiments comprising several gels, a common technique is to include an internal standard in each gel. The internal standard is prepared by mixing together several or all of the samples in the experiment. This allows the measurement of the abundance of a protein in each sample relative to the internal standard. Since the amounts of each protein in the internal standard is known to be the same in every gel, this method reduces inter gel variation.