β-глюкуронидаза: құрылымы, қатысымдары және механизмі

Кіріспе

Ферменттер класы
α глюкуронидаза

инфобокс протеин
| атауы = β Глюкуронидаза
| сурет сипаттамасы = β Глюкуронидазаның асимметриялық бірлігі, белсенді ортақ қалдықтары Glu451, Tyr504 және Glu540, сондай-ақ қолдау көрсетуі мүмкін Asn450 қалдығын көрсетеді. Адам β глюкуронидазасы – глюкуронидазаның бір түрі (гликозидазалар отбасының 2-ші мүшесі), ол гепаран сульфаты сияқты мукополисахаридтердің (гликозаминогликандар деп те аталады) тотықпайтын ұшынан β-D глюкурон қышқылының қалдықтарын гидролиздеуге катализдейді. Адам β глюкуронидазасы лизосомада орналасқан. Ішекте β глюкуронидаза конъюгацияланған билирубинды қайта сіңу үшін конъюгацияланбаған түріне айналдырады. β Глюкуронидаза ана сүтінде де кездеседі, бұл нәрестелердің сарғаюына себеп болуы мүмкін. Адамдарда бұл ақуызды GUSB гені, ал бактерияларда uidA гені кодтайды.

Құрылымы

Адамның β глюкуронидазасы протеолизден бұрын C терминалынан 18 аминқышқылы алынып тасталып, 78 кДа мономерін қалыптастыру үшін 80 кДа мономер (653 аминқышқылы) ретінде синтезделеді. β Глюкуронидаза 332 кДа гомотетрамер түрінде кездеседі. β Глюкуронидаза бірнеше ерекше құрылымдық формацияларды қамтиды, соның ішінде β баррельдің желе ролл баррелі және TIM баррелі деп аталатын түрі бар. Бұл гомологиялық байланыс, гликозидазалардың көбінесе екі қышқыл қалдықтармен катализделген гидролизді орындайтындығы туралы біліммен бірге, механикалық гипотезаның дамуына мүмкіндік берді. Бұл гипотеза екі глутамин қышқылы қалдықтарының Glu540 және Glu451 тиісінше нуклеофильдік және қышқыл қалдықтар болып табылатынын, ал тирозин қалдығы Tyr504 да катализге қатысатынын болжайды. Бұл гипотезаны қолдай отырып, осы үш қалдықтың кез келгеніндегі экспериментальді мутациялар ферменттік белсенділіктің айтарлықтай төмендеуіне әкеледі. Азид қосылғаннан кейін E451A мутантты ферментінің (онда Glu451 аланин қалдығымен алмастырылған) белсенділігінің жоғарылауы Glu451 қышқыл/негіз қалдығы екенін көрсетеді. Зерттеушілер өте тұрақты аралық сатыға енген субстраттың гидролизінен кейін белгіленген β глюкуронидаза пептидтерін талдау арқылы Glu540 нуклеофильді қалдық екенін анықтады. β глюкуронидаза қолданатын нуклеофильді алмастырудың нақты түрі белгісіз болғанымен, гликозидаза отбасындағы олардың гомологтарының механизмдері туралы мәліметтер бұл реакциялар сапалық тұрғыдан SN2 реакциялары екенін көрсетеді. Реакциялар оксокарбений ионының сипаттамалары бар өтпелі күй арқылы өтеді. Бастапқыда, оксокарбенийге тән өтпелі күйдің ерекшелігіне байланысты, бұл механизмдер дискретті оксокарбений ионы аралық түрі арқылы өтетін SN1 реакциялары деп есептелді. Алайда, соңғы мәліметтер оксокарбений иондық күйлерінің өмір сүру ұзақтығы 10 фемтосекундтан 0,1 наносекундқа дейін (байланыс тербеліс периодының ұзақтығына ұқсас) екенін көрсетеді. Бұл өмір сүру ұзақтығы реакция аралықтарына жатқызуға тым қысқа. Осы деректерге сүйенсек, бұл реакциялар SN1 сияқты көрінсе де, олардың өтпелі күйлерінің оксокарбений ионы сипаттамаларына байланысты сапалық тұрғыдан SN2 реакциялары болуы керек. Сурет: бета глюкуронидазадағы Asn 450 белсенділігінің болжамы. JPG. β-глюкуронидазаның қант субстратын тұрақтандыруда сақталған Asn450 қалдығының болжамды белсенділігі. Сурет: Адам бета-глюкуронидазасындағы мүмкін тұз көпірі. Адамның бета глюкуронидазасындағы Glu352 және Arg216 арасындағы әлеуетті тұз көпірі. Жақында зерттеушілер бета глюкуронидаза белсенділігінің жетіспеушілігін көрсететін мысық отбасын анықтады. Белсенділіктің төмендеуінің себебі E351K мутациясы (Glu351 лизин қалдығына мутацияланады) екені анықталды. Glu351 сүтқоректілерде сақталады, бұл қалдықтың маңызды функциясын көрсетеді. Адамның рентгендік кристалдық құрылымын зерттеу нәтижесінде бұл қалдық (адам ферментіндегі Glu352), TIM баррелінің түбінде терең орналасқан, ферменттің үшінші құрылымын тұрақтандыруда маңызды болуы мүмкін екені анықталды. Кристалдық құрылымда ақуыздың желе-ролл доменінің мүшесі Arg216 Glu352мен тұз көпірін құрайды; сондықтан Glu352 ферменттің екі түрлі үш өлшемді домендерінің өзара әрекеттесуін тұрақтандыруға қатысады. Молекулалық графикалық суреттер Калифорния университеті, Сан-Францискодағы Биокомпьютерлік, визуализациялық және информатика ресурсынан алынған Chimera пакетін пайдалана отырып жасалды.

Human β glucuronidase is synthesized as an 80 kDa monomer (653 amino acids) before proteolysis removes 18 amino acids from the C terminal end to form a 78 kDa monomer. β Glucuronidase exists as a 332 kDa homotetramer. β Glucuronidase contains several notable structural formations, including a type of β barrel known as a jelly roll barrel and a TIM barrel. This homologous relationship, along with the knowledge that glycosidases often perform hydrolysis catalyzed by two acidic residues, enabled the development of a mechanistic hypothesis. This hypothesis proposes that the two glutamic acid residues Glu540 and Glu451 are the nucleophilic and acidic residues, respectively, and that the tyrosine residue Tyr504 is also involved in catalysis. In support of this hypothesis, experimental mutations in any of these three residues result in large decreases of enzymatic activity. Increased activity of an E451A mutant enzyme (where Glu451 is replaced with an alanine residue) after addition of azide is consistent with Glu451 as the acid/base residue. Using analysis of labeled β glucuronidase peptides after hydrolysis of a substrate that enters a very stable intermediate stage, researchers have determined that Glu540 is the nucleophilic residue. Though the particular type of nucleophilic substitution employed by β glucuronidase is unclear, evidence for the mechanisms of their homologues in the glycosidase family suggests that these reactions are qualitatively SN2 reactions. The reactions proceed through a transition state with oxocarbenium ion characteristics. Initially, these mechanisms, because of this oxocarbenium characteristic of the transition state, were suggested to be SN1 reactions proceeding through a discrete oxocarbenium ion intermediate. However, more recent evidence suggests that these oxocarbenium ion states have lifetimes of 10 femtoseconds 0.1 nanoseconds (similar to that of a bond vibration period). These lifetimes are too short to assign to a reaction intermediate. From this evidence, it appears that these reactions, while having an SN1 appearance due to the oxocarbenium ion characteristics of their transition states, must be qualitatively SN2 reactions. | Image:Predicted Asn 450 activity in beta glucuronidase. JPG|Predicted activity of the conserved Asn450 residue in stabilization of the β glucuronidase sugar substrate
| Image:Possible Salt Bridge Human Beta Glucuronidase. jpg|Potential salt bridge between Glu352 and Arg216 in human beta glucuronidase More recently researchers have discovered a feline family that exhibits deficiencies in β glucuronidase activity. The source of this reduction of activity has been identified as an E351K mutation (Glu351 is mutated to a lysine residue). Glu351 is conserved in mammalian species, which suggests an important function for this residue. Examination of the human X ray crystal structure suggests that this residue (Glu352 in the human enzyme), which is buried deep within the TIM barrel domain, may be important for stabilization of the tertiary structure of the enzyme. In the crystal structure, it appears that Arg216, a member of the jelly roll domain of the protein, forms a salt bridge with Glu352; therefore, Glu352 is likely involved in stabilizing the interaction between two different three dimensional domains of the enzyme. Molecular graphics images were produced using the Chimera package from the Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco.