Бета-глюкуронидаза: структура, механизм действия и роль в организме.

Введение

Класс ферментов
α-глюкуронидаза

infobox protein
| name = β-Глюкуронидаза
| caption = Асимметричный фрагмент β-глюкуронидазы, демонстрирующий остатки активного центра Glu451, Tyr504 и Glu540, а также потенциально поддерживающий остаток Asn450. Человеческая β-глюкуронидаза является типом глюкуронидазы (член семейства гликозидаз 2), которая катализирует гидролиз остатков β-D-глюкуроновой кислоты с невосстанавливающего конца мукополисахаридов (также называемых гликозаминогликанами), таких как гепарансульфат. Человеческая β-глюкуронидаза локализована в лизосоме. В кишечнике щеточная каёмка β-глюкуронидаза превращает конъюгированный билирубин в неконъюгированную форму для реабсорбции. β-Глюкуронидаза также присутствует в грудном молоке, что способствует развитию неонатальной желтухи. Белок кодируется геном GUSB у человека и геном uidA у бактерий.

Структура

В человеческом организме β-глюкуронидаза синтезируется в виде мономера 80 кДа (653 аминокислоты), прежде чем протеолиз удаляет 18 аминокислот с C-концевого конца для образования мономера 78 кДа. β-глюкуронидаза существует в виде гомотетрамера 332 кДа. β-глюкуронидаза содержит несколько заметных структурных образований, включая тип β-бареля, известный как «желе-ролл» барель, и TIM-барель. Эта гомологичная связь, а также знание о том, что гликозидазы часто катализируют гидролиз с помощью двух кислотных остатков, позволило разработать механистическую гипотезу. Эта гипотеза предполагает, что два остатка глутаминовой кислоты Glu540 и Glu451 являются нуклеофильным и кислотным остатками соответственно, а остаток тирозина Tyr504 также участвует в катализе. В поддержку этой гипотезы экспериментальные мутации в любом из этих трех остатков приводят к значительному снижению ферментативной активности. Повышенная активность мутантного фермента E451A (где Glu451 заменен остатком аланина) после добавления азида согласуется с тем, что Glu451 является кислотно-основным остатком. Используя анализ пептидов β-глюкуронидазы после гидролиза субстрата, который входит в очень стабильную промежуточную стадию, исследователи определили, что Glu540 является нуклеофильным остатком. Хотя конкретный тип нуклеофильного замещения, используемого β-глюкуронидазой, неясен, данные о механизмах ее гомологов в семействе гликозидаз указывают на то, что эти реакции качественно являются SN2-реакциями. Реакции протекают через переходное состояние с характеристиками оксокарбениевого иона. Первоначально, из-за этой характеристики оксокарбениевого иона в переходном состоянии, эти механизмы предполагались SN1-реакциями, протекающими через дискретный промежуточный оксокарбениевый ион. Однако более поздние данные свидетельствуют о том, что время жизни этих оксокарбениевых ионов составляет от 10 фемтосекунд до 0,1 наносекунды (что сопоставимо с периодом колебаний связи). Эти сроки слишком коротки, чтобы их можно было отнести к промежуточному продукту реакции. Таким образом, можно сделать вывод, что эти реакции, хотя и имеют SN1-подобный вид из-за характеристик оксокарбениевого иона в их переходных состояниях, качественно являются SN2-реакциями. | Изображение: Прогнозируемая активность Asn 450 в β-глюкуронидазе. JPG | Прогнозируемая активность консервативного остатка Asn450 в стабилизации сахарного субстрата β-глюкуронидазы. | Изображение: Возможный солевой мостик в человеческой β-глюкуронидазе. jpg | Потенциальный солевой мостик между Glu352 и Arg216 в человеческой β-глюкуронидазе. Недавно исследователи обнаружили семейство кошек, демонстрирующих дефицит активности β-глюкуронидазы. Причиной этого снижения активности была идентифицирована мутация E351K (замена Glu351 на остаток лизина). Glu351 консервативен у млекопитающих, что указывает на важную функцию этого остатка. Изучение кристаллической структуры рентгеновского излучения человека предполагает, что этот остаток (Glu352 в человеческом ферменте), который глубоко погружен в домен TIM-бареля, может быть важен для стабилизации третичной структуры фермента. В кристаллической структуре видно, что Arg216, компонент «желе-ролл» домена белка, образует солевой мостик с Glu352; следовательно, Glu352, вероятно, участвует в стабилизации взаимодействия между двумя различными трехмерными доменами фермента. Молекулярно-графические изображения были созданы с использованием пакета Chimera из Ресурса по биокомпьютингу, визуализации и информатике Калифорнийского университета в Сан-Франциско.

Human β glucuronidase is synthesized as an 80 kDa monomer (653 amino acids) before proteolysis removes 18 amino acids from the C terminal end to form a 78 kDa monomer. β Glucuronidase exists as a 332 kDa homotetramer. β Glucuronidase contains several notable structural formations, including a type of β barrel known as a jelly roll barrel and a TIM barrel. This homologous relationship, along with the knowledge that glycosidases often perform hydrolysis catalyzed by two acidic residues, enabled the development of a mechanistic hypothesis. This hypothesis proposes that the two glutamic acid residues Glu540 and Glu451 are the nucleophilic and acidic residues, respectively, and that the tyrosine residue Tyr504 is also involved in catalysis. In support of this hypothesis, experimental mutations in any of these three residues result in large decreases of enzymatic activity. Increased activity of an E451A mutant enzyme (where Glu451 is replaced with an alanine residue) after addition of azide is consistent with Glu451 as the acid/base residue. Using analysis of labeled β glucuronidase peptides after hydrolysis of a substrate that enters a very stable intermediate stage, researchers have determined that Glu540 is the nucleophilic residue. Though the particular type of nucleophilic substitution employed by β glucuronidase is unclear, evidence for the mechanisms of their homologues in the glycosidase family suggests that these reactions are qualitatively SN2 reactions. The reactions proceed through a transition state with oxocarbenium ion characteristics. Initially, these mechanisms, because of this oxocarbenium characteristic of the transition state, were suggested to be SN1 reactions proceeding through a discrete oxocarbenium ion intermediate. However, more recent evidence suggests that these oxocarbenium ion states have lifetimes of 10 femtoseconds 0.1 nanoseconds (similar to that of a bond vibration period). These lifetimes are too short to assign to a reaction intermediate. From this evidence, it appears that these reactions, while having an SN1 appearance due to the oxocarbenium ion characteristics of their transition states, must be qualitatively SN2 reactions. | Image:Predicted Asn 450 activity in beta glucuronidase. JPG|Predicted activity of the conserved Asn450 residue in stabilization of the β glucuronidase sugar substrate
| Image:Possible Salt Bridge Human Beta Glucuronidase. jpg|Potential salt bridge between Glu352 and Arg216 in human beta glucuronidase More recently researchers have discovered a feline family that exhibits deficiencies in β glucuronidase activity. The source of this reduction of activity has been identified as an E351K mutation (Glu351 is mutated to a lysine residue). Glu351 is conserved in mammalian species, which suggests an important function for this residue. Examination of the human X ray crystal structure suggests that this residue (Glu352 in the human enzyme), which is buried deep within the TIM barrel domain, may be important for stabilization of the tertiary structure of the enzyme. In the crystal structure, it appears that Arg216, a member of the jelly roll domain of the protein, forms a salt bridge with Glu352; therefore, Glu352 is likely involved in stabilizing the interaction between two different three dimensional domains of the enzyme. Molecular graphics images were produced using the Chimera package from the Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics at the University of California, San Francisco.