Агароза: структура, свойства и применение гетерополисахарида из красных водорослей.

Введение

Гетерополисахарид, содержащийся в красных водорослях.

Агароза – это гетерополисахарид, обычно извлекаемый из определенных видов красных водорослей. Это линейный полимер, состоящий из повторяющихся звеньев агаробиозы, которая является дисахаридом, образованным D-галактозой и 3,6-ангидро-L-галактопиранозой. Агароза является одним из двух основных компонентов агара и выделяется из агара путем удаления другого его компонента – агаропектина. Агароза широко используется в молекулярной биологии для разделения крупных молекул, особенно ДНК, методом электрофореза. Плиты агарозного геля (обычно 0,7–2%) для электрофореза легко приготавливаются путем заливки теплого жидкого раствора в форму. Для этих целей коммерчески доступен широкий спектр агароз с различной молекулярной массой и свойствами. Агарозу также можно формовать в гранулы и использовать в различных хроматографических методах для очистки белков.

Структура

Агароза — линейный полимер с молекулярной массой около 120 000, состоящий из чередующихся D-галактозы и 3,6-ангидро-L-галактопиранозы, связанных α (1→3) и β (1→4) гликозидными связями. 3,6-ангидро-L-галактопираноза представляет собой L-галактозу с ангидромостом между 3-й и 6-й позициями, хотя некоторые L-галактозные звенья в полимере могут не содержать этот мост. Некоторые звенья D-галактозы и L-галактозы могут быть метилированы, а пируват и сульфат также присутствуют в небольших количествах. Каждая цепь агарозы содержит около 800 молекул галактозы, а полимерные цепи агарозы образуют спиральные волокна, которые агрегируют в суперспиральную структуру с радиусом 20–30 нанометров (нм). Волокна квазижесткие и имеют широкий диапазон длин в зависимости от концентрации агарозы. При затвердевании волокна формируют трехмерную сетку каналов диаметром от 50 до >200 нм, в зависимости от концентрации используемой агарозы; более высокие концентрации приводят к уменьшению среднего диаметра пор. Трехмерная структура поддерживается водородными связями и поэтому может быть разрушена при нагревании до жидкого состояния.

Свойства

Агароза выпускается в виде белого порошка, который растворяется в почти кипящей воде и образует гель при охлаждении. Агароза проявляет феномен термической гистерезиса при переходе из жидкого состояния в гель, то есть гелируется и плавится при разных температурах. Температуры гелирования и плавления варьируются в зависимости от типа агарозы. Стандартные агарозы, полученные из Gelidium, имеют температуру гелирования и температуру плавления , в то время как агарозы, полученные из Gracilaria, из-за более высокого содержания метокси-заместителей, имеют температуру гелирования и температуру плавления . Температуры плавления и гелирования могут зависеть от концентрации геля, особенно при низкой концентрации менее 1%. Поэтому температуры гелирования и плавления указываются для определенной концентрации агарозы. Натуральная агароза содержит незаряженные метильные группы, а степень метилирования прямо пропорциональна температуре гелирования. Однако синтетическая метилизация оказывает обратный эффект: увеличение метилирования снижает температуру гелирования. Различные химически модифицированные агарозы с разными температурами плавления и гелирования доступны благодаря химическим модификациям. Агароза в геле образует сетчатую структуру, содержащую поры, размер которых зависит от концентрации добавленной агарозы. При хранении гели агарозы подвержены синерезу (выдавливанию воды через поверхность геля), но этот процесс достаточно медленный, чтобы не мешать использованию геля. Гель агарозы может обладать высокой прочностью при низкой концентрации, что делает его подходящим в качестве среды, предотвращающей конвекцию, для гелевого электрофореза. Гели агарозы концентрацией всего 0,15% могут формировать пластины для гелевого электрофореза. Электроэндосмос – причина, по которой агароза предпочтительнее агара, поскольку агаропектин в агаре содержит значительное количество отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп. Удаление агаропектина из агарозы существенно снижает электроэндосмотическую подвижность (ЭЭП), а также уменьшает неспецифическую адсорбцию биомолекул в гелевую матрицу. Однако для некоторых применений, таких как электрофорез белков сыворотки, высокая ЭЭП может быть желательной, и агаропектин может быть добавлен в используемый гель.

Agarose is available as a white powder which dissolves in near boiling water, and forms a gel when it cools. Agarose exhibits the phenomenon of thermal hysteresis in its liquid to gel transition, i. e. it gels and melts at different temperatures. The gelling and melting temperatures vary depending on the type of agarose. Standard agaroses derived from Gelidium has a gelling temperature of and a melting temperature of , while those derived from Gracilaria, due to its higher methoxy substituents, has a gelling temperature of and melting temperature of The melting and gelling temperatures may be dependent on the concentration of the gel, particularly at low gel concentration of less than 1%. The gelling and melting temperatures are therefore given at a specified agarose concentration. Natural agarose contains uncharged methyl groups and the extent of methylation is directly proportional to the gelling temperature. Synthetic methylation however have the reverse effect, whereby increased methylation lowers the gelling temperature. A variety of chemically modified agaroses with different melting and gelling temperatures are available through chemical modifications. The agarose in the gel forms a meshwork that contains pores, and the size of the pores depends on the concentration of agarose added. On standing, the agarose gels are prone to syneresis (extrusion of water through the gel surface), but the process is slow enough to not interfere with the use of the gel. Agarose gel can have high gel strength at low concentration, making it suitable as an anti convection medium for gel electrophoresis. Agarose gels as dilute as 0.15% can form slabs for gel electrophoresis. Electroendosmosis is a reason agarose is used preferentially over agar as agaropectin in agar contains a significant amount of negatively charged sulphate and carboxyl groups. The removal of agaropectin in agarose substantially reduces the EEO, as well as reducing the non specific adsorption of biomolecules to the gel matrix. However, for some applications such as the electrophoresis of serum protein, a high EEO may be desirable, and agaropectin may be added in the gel used.

Агарозы с низкой температурой плавления и гелирования

Температура плавления и гелеобразования агарозы может быть изменена химическими модификациями, наиболее распространенной из которых является гидроксиэтилирование, которое уменьшает количество внутрицепочечных водородных связей, что приводит к более низким температурам плавления и застывания по сравнению со стандартными агарозами. Точная температура определяется степенью замещения, и многие доступные агарозы с низкой температурой плавления (LMP) могут оставаться в жидком состоянии в определенном диапазоне. Это свойство позволяет проводить ферментативные манипуляции непосредственно после электрофореза ДНК-геля путем добавления в реакционную смесь срезов расплавленного геля, содержащих интересующий фрагмент ДНК. Агароза LMP содержит меньше сульфатов, которые могут влиять на некоторые ферментативные реакции, и поэтому предпочтительна для некоторых применений. Гидроксиэтилированная агароза также имеет меньший размер пор (~90 нм), чем стандартные агарозы. Гидроксиэтилирование может уменьшить размер пор за счет снижения плотности упаковки пучков агарозы, поэтому гель LMP также может влиять на время и разделение во время электрофореза. Агарозы с ультранизкой температурой плавления или гелеобразования могут застывать только при.

Приложения

Агароза является предпочтительной матрицей для работы с белками и нуклеиновыми кислотами, поскольку обладает широким диапазоном физической, химической и термической стабильности, а её меньшая химическая сложность также снижает вероятность взаимодействия с биомолекулами. Агароза наиболее часто используется в качестве среды для аналитического электрофоретического разделения в электрофорезе в агарозном геле. Гели, изготовленные из очищенной агарозы, имеют относительно большие поры, что делает их пригодными для разделения крупных молекул, таких как белки и белковые комплексы с молекулярной массой более 200 килодальтон, а также фрагменты ДНК длиной более 100 пар оснований. Агароза также широко применяется в ряде других областей, например, в иммунодиффузии и иммуноэлектрофорезе, поскольку агарозные волокна могут служить якорем для иммунокомплексов.

Электрофорез в геле агарозы

Электрофорез в агарозном геле – стандартный метод разделения ДНК в лаборатории. Агарозные гели обладают меньшей разрешающей способностью для ДНК, чем акриламидные гели, но имеют больший диапазон разделения, и поэтому обычно используются для фрагментов ДНК длиной от 50 до 20 000 пар оснований (bp), хотя разрешение более 6 Мб возможно при импульсном гелевом электрофорезе (PFGE). Его также можно использовать для разделения крупных молекул белков, и он является предпочтительной матрицей для электрофореза частиц с эффективными радиусами более 5 × 10 нм. Размер пор геля влияет на размер ДНК, которую можно просеять. Чем ниже концентрация геля, тем больше размер пор и тем большая ДНК может быть просеяна. Однако гели с низкой концентрацией (0,1–0,2%) хрупкие и, следовательно, трудны в обращении, а электрофорез крупных молекул ДНК может занимать несколько дней. Предел разрешения для стандартного электрофореза в агарозном геле составляет около 750 кб. Гранулы высокопористые, поэтому белки могут свободно протекать сквозь них. Эти гранулы на основе агарозы обычно мягкие и легко разрушаются, поэтому их следует использовать при гравитационном потоке, центрифугировании при низкой скорости или процедурах с низким давлением. Прочность смол можно улучшить за счет увеличения степени сшивания и химического упрочнения агарозных смол, однако такие изменения также могут привести к снижению способности связывания с белком в некоторых процедурах разделения, таких как аффинная хроматография. Агароза – полезный материал для хроматографии, поскольку она не абсорбирует биомолекулы в значительной степени, обладает хорошими свойствами потока и может выдерживать экстремальные значения pH и ионной силы, а также высокую концентрацию денатурирующих веществ, таких как 8 М мочевина или 6 М гуанидин HCl. Примеры матриц на основе агарозы для гель-фильтрационной хроматографии включают Sepharose и WorkBeads 40 SEC (сшитая гранулированная агароза), Praesto и Superose (высокосшитая гранулированная агароза) и Superdex (декстран, ковалентно связанный с агарозой). Для аффинной хроматографии гранулированная агароза является наиболее часто используемой матричной смолой для прикрепления лигандов, связывающих белки. Лиганды ковалентно связаны через спейсер с активированными гидроксильными группами полимера агарозных гранул. Затем интересующие белки могут избирательно связываться с лигандами для отделения их от других белков, после чего их можно элюировать. Используемые агарозные гранулы обычно имеют плотность 4% и 6% и обладают высокой способностью связывать белки.

Agarose gel electrophoresis is the routine method for resolving DNA in the laboratory. Agarose gels have lower resolving power for DNA than acrylamide gels, but they have greater range of separation, and are therefore usually used for DNA fragments with lengths of 50–20,000 bp (base pairs), although resolution of over 6 Mb is possible with pulsed field gel electrophoresis (PFGE). It can also be used to separate large protein molecules, and it is the preferred matrix for the gel electrophoresis of particles with effective radii larger than 5 10 nm. The pore size of the gel affects the size of the DNA that can be sieved. The lower the concentration of the gel, the larger the pore size, and the larger the DNA that can be sieved. However low concentration gels (0.1 0.2%) are fragile and therefore hard to handle, and the electrophoresis of large DNA molecules can take several days. The limit of resolution for standard agarose gel electrophoresis is around 750 kb. The beads are highly porous so that protein may flow freely through the beads. These agarose based beads are generally soft and easily crushed, so they should be used under gravity flow, low speed centrifugation, or low pressure procedures. The strength of the resins can be improved by increased cross linking and chemical hardening of the agarose resins, however such changes may also result in a lower binding capacity for protein in some separation procedures such as affinity chromatography. Agarose is a useful material for chromatography because it does not absorb biomolecules to any significant extent, has good flow properties, and can tolerate extremes of pH and ionic strength as well as high concentration of denaturants such as 8M urea or 6M guanidine HCl. Examples of agarose based matrix for gel filtration chromatography are Sepharose and WorkBeads 40 SEC (cross linked beaded agarose), Praesto and Superose (highly cross linked beaded agaroses), and Superdex (dextran covalently linked to agarose). For affinity chromatography, beaded agarose is the most commonly used matrix resin for the attachment of the ligands that bind protein. The ligands are linked covalently through a spacer to activated hydroxyl groups of agarose bead polymer. Proteins of interest can then be selectively bound to the ligands to separate them from other proteins, after which it can be eluted. The agarose beads used are typically of 4% and 6% densities with a high binding capacity for protein.

Твердые среды культивирования

Пластины из агарозы иногда могут использоваться вместо агара для культивирования организмов, так как агар может содержать примеси, способные повлиять на рост организма или некоторые последующие процедуры, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Агароза также более твердая, чем агар, и поэтому может быть предпочтительнее, когда необходима более высокая прочность геля, а её более низкая температура гелеобразования может предотвратить термический шок для организма, когда клетки находятся во взвешенном состоянии в жидкости перед гелеобразованием. Она может использоваться для культивирования строгих автотрофных бактерий, растительных протопластов, Caenorhabditis elegans, других организмов и различных клеточных линий.

Анализы подвижности

Агарозу иногда используют вместо агара для измерения подвижности и мобильности микроорганизмов. Подвижные виды смогут мигрировать, хотя и медленно, сквозь пористый гель, и можно будет визуализировать скорость инфильтрации. Пористость геля напрямую связана с концентрацией агара или агарозы в среде, поэтому гели различной концентрации могут использоваться для оценки плавания, роения, скольжения и рывковых движений клетки. В анализе миграции клеток с использованием агарозы можно измерять химиотаксис и химиокинез. Между популяцией клеток и хемоаттрактантом помещают слой агарозного геля. По мере развития градиента концентрации, возникающего в результате диффузии хемоаттрактанта в геле, различные популяции клеток, требующие разного уровня стимуляции для миграции, можно визуализировать с течением времени с помощью микрофотографии, наблюдая за их движением вверх сквозь гель против силы тяжести вдоль градиента.