Белки теплового шока 70 кДа: структура, функции и регуляция.

Введение

Семейство белков теплового шока

70-килодальтонные белки теплового шока (Hsp70s или DnaK) — это семейство консервативных, повсеместно экспрессируемых белков теплового шока. Белки с аналогичной структурой существуют практически во всех живых организмах. Внутриклеточные Hsp70 являются важной частью клеточного механизма, обеспечивающего правильное сворачивание белков, выполняют шаперонные функции и помогают защищать клетки от негативного воздействия физиологических стрессов. Кроме того, мембранно-связанные Hsp70 были идентифицированы как потенциальная мишень для терапии рака, а их внеклеточные аналоги обладают как мембранно-связанными, так и немембранными структурами.

Открытие

Члены семейства Hsp70 очень сильно активируются тепловым стрессом и токсичными химическими веществами, особенно тяжелыми металлами, такими как мышьяк, кадмий, медь, ртуть и т.д. Тепловой шок был впервые обнаружен Ферруччо Ритоссой в 1960-х годах, когда лаборант случайно повысил температуру инкубации дрозофилы (плодовых мушек). При изучении хромосом Ритосса обнаружил "паттерн пуффингов", указывающий на усиленную транскрипцию генов неизвестного белка. Впоследствии это было описано как "Реакция на тепловой шок", а белки получили название "Белки теплового шока" (Hsps).

Структура

[[Файл:Рисунок Схематические домены семейства Hsp70 и Вторичные структуры семейства Hsp70.jpg|thumb|360px|(a) Схематические домены Hsp70. Hsp70 состоят из двух высококонсервативных функциональных доменов, включая NBD и C-концевой субстрат-связывающий домен (SBD), а также EEVD-мотив в C-конце. NBD содержит ATP/ADP-карман, который связывает, а SBD содержит субстрат-связывающий карман, который взаимодействует с протяженными полипептидами в качестве субстрата. α-спиральная субдомена с C-конца SBD формирует гибкую крышку. EEVD-мотив участвует в связывании с ко-шаперонами и другими белками семейства HSP. (b) Полная аминокислотная последовательность человеческого Hsp70 (идентификатор UniProtKB: P0DMV8) как основного стресс-индуцируемого члена семейства Hsp70. (c) Вторичные структуры Hsp70, визуализированные с использованием программного обеспечения VMD 1.9.1. Hsp70, белок теплового шока 70 кДа; NBD, N-концевой нуклеотид-связывающий домен; SBD, субстрат-связывающий домен в C-конце. Фосфорилирование изолированного остатка серина протеинкиназой. Фосфорилирование белка, посттрансляционная модификация, способствует регуляции функции белка и включает в себя фосфорилирование аминокислот с гидроксильными группами в их боковых цепях (у эукариот). Серин, треонин и тирозин являются распространенными мишенями для фосфорилирования. Фосфорилирование Hsp70 стало предметом более активного изучения в научной литературе относительно недавно. Публикация 2020 года предполагает, что фосфорилирование серинового остатка между NBD и субстрат-связывающим доменом в дрожжевых Hsp70 приводит к значительному снижению нормальной реакции теплового шока Hsp70. Эта деактивация посредством фосфорилирования является распространенным мотивом в регуляции белка и демонстрирует, как относительно небольшие изменения в структуре белка могут оказывать биологически значимое влияние на его функцию.

Функция

Система Hsp70 взаимодействует с протяженными пептидными фрагментами белков, а также с частично свернутыми белками, вызывая агрегацию белков в ключевых путях и снижая их активность. Когда Hsp70 не связан с пептидным субстратом, он обычно находится в состоянии, связанном с АТФ. Сам по себе Hsp70 характеризуется очень слабой АТФазной активностью, поэтому спонтанный гидролиз не происходит в течение многих минут. По мере выхода вновь синтезированных белков из рибосом, домен связывания субстрата Hsp70 распознает последовательности гидрофобных аминокислотных остатков и взаимодействует с ними. Это спонтанное взаимодействие обратимо, и в состоянии, связанном с АТФ, Hsp70 может относительно свободно связывать и высвобождать пептиды. Однако присутствие пептида в связывающем домене стимулирует АТФазную активность Hsp70, увеличивая его обычно медленную скорость гидролиза АТФ. Когда АТФ гидролизуется до АДФ, связывающий карман Hsp70 закрывается, прочно связывая захваченную пептидную цепь. Дальнейшее ускорение гидролиза АТФ обеспечивают так называемые кошапероны домена J: в основном Hsp40 у эукариот и DnaJ у прокариот. Эти кошапероны значительно увеличивают АТФазную активность Hsp70 в присутствии взаимодействующих пептидов. [[Файл:Figure Hsp70 function cycle. jpg|Функция Hsp70 как в (пере)сворачивании, так и в деградации неправильно свернутого белка-клиента. (a) Схема цикла Hsp70 АТФ–АДФ для (пере)сворачивания белка-клиента, вызывающего конформационное изменение шаперона, гидролиз АТФ и обмен. (b) Комплекс Hsp70–CHIP, способствующий убиквитинированию белка-клиента и деградации протеасомой. CHIP взаимодействует с TPR-доменом Hsp70 и действует как убиквитин-лигаза для клиентов. CHIP, иммунопреципитация хроматина; Hsp70, белок теплового шока 70 кДа; TPR, тетратрикопептид-повторяющийся домен. HOP (организующий белок Hsp70/Hsp90) может связываться как с Hsp70, так и с Hsp90 одновременно и опосредует передачу пептидов от Hsp70 к Hsp90. Hsp70 также способствует трансмембранному транспорту белков, стабилизируя их в частично свернутом состоянии. Также известно, что он фосфорилируется, что регулирует некоторые из его функций. Белки Hsp70 могут защищать клетки от теплового или окислительного стресса. Эти стрессы обычно повреждают белки, вызывая частичное разворачивание и возможное агрегирование. Временно связываясь с гидрофобными остатками, обнаженными в результате стресса, Hsp70 предотвращает агрегацию этих частично денатурированных белков и препятствует их повторному сворачиванию. Низкий уровень АТФ характерен для теплового шока, и устойчивое связывание рассматривается как подавление агрегации, в то время как восстановление после теплового шока включает связывание субстрата и циклирование нуклеотидов. У термофильного анаэроба (Thermotoga maritima) Hsp70 демонстрирует чувствительное к окислительно-восстановительному потенциалу связывание с модельными пептидами, что указывает на второй механизм регуляции связывания, основанный на окислительном стрессе. Hsp70, по-видимому, способен участвовать в утилизации поврежденных или дефектных белков. Взаимодействие с CHIP (взаимодействующим с карбоксильным концом Hsp70 белком) – E3 убиквитин-лигазой – позволяет Hsp70 передавать белки в клеточные пути убиквитинизации и протеолиза. Наконец, помимо повышения общей целостности белка, Hsp70 непосредственно ингибирует апоптоз. Одним из признаков апоптоза является высвобождение цитохрома c, который затем рекрутирует Apaf 1 и dATP/ATP в апоптосомный комплекс. Этот комплекс затем расщепляет про-каспазу 9, активируя каспазу 9 и в конечном итоге индуцируя апоптоз через активацию каспазы 3. Hsp70 ингибирует этот процесс, блокируя рекрутирование про-каспазы 9 к апоптосомному комплексу Apaf 1/dATP/цитохром c. Он не связывается непосредственно с сайтом связывания про-каспазы 9, но, вероятно, индуцирует конформационное изменение, которое делает связывание про-каспазы 9 менее благоприятным. Показано, что Hsp70 взаимодействует с белком IRE1alpha, сенсором стресса эндоплазматического ретикулума, тем самым защищая клетки от апоптоза, вызванного стрессом ЭР. Это взаимодействие продлило сплайсинг мРНК XBP 1, тем самым индуцируя транскрипционную регуляцию мишеней сплайсированного XBP 1, таких как EDEM1, ERdj4 и P58IPK, спасая клетки от апоптоза. Другие исследования показывают, что Hsp70 может играть антиапоптотическую роль на других этапах, но не участвует в апоптозе, опосредованном Fas-лигандом (хотя Hsp 27 участвует). Поэтому Hsp70 не только спасает важные компоненты клетки (белки), но и непосредственно спасает клетку в целом. Учитывая, что белки ответа на стресс (такие как Hsp70) эволюционировали до апоптотических механизмов, прямая роль Hsp70 в ингибировании апоптоза представляет собой интересный эволюционный взгляд на то, как более поздние (апоптотические) механизмы приспособились к предыдущим механизмам (Hsp), тем самым согласовывая улучшенную целостность клеточных белков с улучшенными шансами на выживание этой конкретной клетки. У мышей экзогенный рекомбинантный человеческий Hsp70 (eHsp70), вводимый интраназально, увеличивает продолжительность жизни. Хотя максимальная продолжительность жизни увеличилась лишь умеренно, общая смертность у обработанных животных была значительно ниже по сравнению с контрольной группой. Кроме того, эта обработка eHsp70 улучшает обучение и память мышей в пожилом возрасте, повышая их любопытство.

The Hsp70 system interacts with extended peptide segments of proteins as well as partially folded proteins to cause aggregation of proteins in key pathways to downregulate activity. When not interacting with a substrate peptide, Hsp70 is usually in an ATP bound state. Hsp70 by itself is characterized by a very weak ATPase activity, such that spontaneous hydrolysis will not occur for many minutes. As newly synthesized proteins emerge from the ribosomes, the substrate binding domain of Hsp70 recognizes sequences of hydrophobic amino acid residues, and interacts with them. This spontaneous interaction is reversible, and in the ATP bound state Hsp70 may relatively freely bind and release peptides. However, the presence of a peptide in the binding domain stimulates the ATPase activity of Hsp70, increasing its normally slow rate of ATP hydrolysis. When ATP is hydrolyzed to ADP the binding pocket of Hsp70 closes, tightly binding the now trapped peptide chain. Further speeding ATP hydrolysis are the so called J domain cochaperones: primarily Hsp40 in eukaryotes, and DnaJ in prokaryotes. These cochaperones dramatically increase the ATPase activity of Hsp70 in the presence of interacting peptides. [[File:Figure Hsp70 function cycle. jpg|The function of Hsp70 in both (re) folding and degradation of misfolded client protein. (a) Schematic of the Hsp70 ATP–ADP cycle for (re) folding of client protein which causes a conformational change of the chaperone, ATP hydrolysis, and exchange. (b) Hsp70–CHIP complex that promotes client protein ubiquitination and proteasomal degradation. CHIP interacts with the TPR domain of Hsp70 and acts as a ubiquitin ligase for clients. CHIP, chromatin immunoprecipitation; Hsp70, heat shock protein 70 kDa; TPR, tetratricopeptide‐repeat domain HOP (the Hsp70/Hsp90 Organizing Protein) can bind to both Hsp70 and Hsp90 at the same time, and mediates the transfer of peptides from Hsp70 to Hsp90. Hsp70 also aids in transmembrane transport of proteins, by stabilizing them in a partially folded state. It is also known to be phosphorylated which regulates several of its functions. Hsp70 proteins can act to protect cells from thermal or oxidative stress. These stresses normally act to damage proteins, causing partial unfolding and possible aggregation. By temporarily binding to hydrophobic residues exposed by stress, Hsp70 prevents these partially denatured proteins from aggregating, and inhibits them from refolding. Low ATP is characteristic of heat shock and sustained binding is seen as aggregation suppression, while recovery from heat shock involves substrate binding and nucleotide cycling. In a thermophile anaerobe (Thermotoga maritima) the Hsp70 demonstrates redox sensitive binding to model peptides, suggesting a second mode of binding regulation based on oxidative stress. Hsp70 seems to be able to participate in disposal of damaged or defective proteins. Interaction with CHIP (Carboxyl terminus of Hsp70 Interacting Protein)–an E3 ubiquitin ligase–allows Hsp70 to pass proteins to the cell's ubiquitination and proteolysis pathways. Finally, in addition to improving overall protein integrity, Hsp70 directly inhibits apoptosis. One hallmark of apoptosis is the release of cytochrome c, which then recruits Apaf 1 and dATP/ATP into an apoptosome complex. This complex then cleaves procaspase 9, activating caspase 9 and eventually inducing apoptosis via caspase 3 activation. Hsp70 inhibits this process by blocking the recruitment of procaspase 9 to the Apaf 1/dATP/cytochrome c apoptosome complex. It does not bind directly to the procaspase 9 binding site, but likely induces a conformational change that renders procaspase 9 binding less favorable. Hsp70 is shown to interact with Endoplasmic reticulum stress sensor protein IRE1alpha thereby protecting the cells from ER stress induced apoptosis. This interaction prolonged the splicing of XBP 1 mRNA thereby inducing transcriptional upregulation of targets of spliced XBP 1 like EDEM1, ERdj4 and P58IPK rescuing the cells from apoptosis. Other studies suggest that Hsp70 may play an anti apoptotic role at other steps, but is not involved in Fas ligand mediated apoptosis (although Hsp 27 is). Therefore, Hsp70 not only saves important components of the cell (the proteins) but also directly saves the cell as a whole. Considering that stress response proteins (like Hsp70) evolved before apoptotic machinery, Hsp70's direct role in inhibiting apoptosis provides an interesting evolutionary picture of how more recent (apoptotic) machinery accommodated previous machinery (Hsps), thus aligning the improved integrity of a cell's proteins with the improved chances of that particular cell's survival. In mice, exogenous recombinant human Hsp70 (eHsp70), delivered intranasally, increases lifespan. Although the maximum lifespan increased only moderately, the overall mortality rate in treated animals was much lower compared with the control group. Also this eHsp70 treatment improves learning and memory of mice in old age, increases their curiosity.

Рак

Hsp70 сверхэкспрессируется при злокачественной меланоме и недостаточно экспрессируется при раке почечных клеток. В клеточной линии рака молочной железы (MCF7) было обнаружено, что не только Hsp90 взаимодействует с эстрогеновым рецептором альфа (ERα), но и Hsp70 1 и Hsc70 также взаимодействуют с ERα. Учитывая роль белков теплового шока как древней системы защиты для стабилизации клеток и элиминации старых и поврежденных клеток, эта система была кооптирована раковыми клетками для стимуляции их роста. Повышение уровня Hsp70, в частности, показало способность ингибировать апоптоз раковых клеток, а повышенная экспрессия Hsp70 связана с развитием или непосредственно вызывает рак эндометрия, легких, толстой кишки, простаты и молочной железы, а также лейкемию. Hsp70 в раковых клетках может быть ответственен за опухолеобразование и прогрессирование опухоли, обеспечивая устойчивость к химиотерапии. Ингибирование Hsp70 показало способность уменьшать размер опухолей и вызывать их полную регрессию. Hsp70/Hsp90 является особенно привлекательной терапевтической мишенью, поскольку его регуляция осуществляется путем ингибирования АТФ-азной активности, в то время как другие HSP регулируются нуклеотидами. Для Hsp70 разработано несколько ингибиторов, которые в настоящее время проходят клинические испытания, хотя на данный момент ингибиторы HSP90 показали большую эффективность. Кроме того, Hsp70 является регулятором иммунной системы, активируя ее как антиген. Таким образом, Hsp70, выделяемый опухолью, был предложен в качестве потенциальной вакцины или направления для иммунотерапии. Учитывая повышенную экспрессию Hsp70 при раке, он был предложен в качестве биомаркера для прогноза рака, при этом высокие уровни указывают на неблагоприятный прогноз. Онкогенный механизм демонстрирует, как внеклеточные везикулы, экспрессирующие HSP70, продуцируются пролиферирующими клетками острой лимфобластной лейкемии и могут поражать и нарушать функцию здоровой системы гематопоэза в процессе развития лейкемии.

Экспрессия в кожных тканях

Как Hsp70, так и HSP47 были обнаружены в дерме и эпидермисе после лазерного облучения, и пространственные и временные изменения в паттернах экспрессии HSP определяют зону термического повреждения, вызванного лазером, и процесс заживления тканей. Hsp70 может биохимически очерчивать зону термического повреждения, в которой клетки подвергаются разрушению, а HSP47 может отражать процесс восстановления после термически индуцированного повреждения. HSP70 способствует защите кожи от повышенной выработки меланина и образования морщин, вызванных воздействием УФ-излучения.

Нейродегенерация

Ингибирование Hsp90 приводит к повышению уровня экспрессии Hsp70 и Hsp40, что может направлять неправильно свернутые белки к деградации протеасомой, потенциально замедляя прогрессирование нейродегенеративных заболеваний. Например, сверхэкспрессия Hsp70 в клетках человеческой нейроглиомы, трансфицированных мутантным альфа-синуклеином, привела к снижению количества олигомерных форм альфа-синуклеина на 50%, что указывает на возможность уменьшения распространения болезни Паркинсона при увеличении его экспрессии. Аналогично, сверхэкспрессия Hsp70 подавляла поли-Q-зависимую агрегацию и нейродегенерацию в клеточных культурах, моделях на дрожжах, мухах и мышах, а делеция hsp70 увеличивала размер поли-Q-включений, что позволяет предположить, что повышение его экспрессии может помочь предотвратить болезнь Гентингтона. Снижение уровня Hsp70 также наблюдалось в трансгенных моделях мышей с БАС и у пациентов со спорадическим БАС. Кроме того, повышение экспрессии или активности Hsp70 было предложено в качестве метода предотвращения прогрессирования болезни Альцгеймера, поскольку подавление экспрессии Hsp70 усиливало Aβ-токсичность, а Hsp70 способствовал стабилизации тау-белка, в то время как уровень Hsp70 снижается при таупатиях, таких как болезнь Альцгеймера. Учитывая сложное взаимодействие между различными белками-шаперонами, разработка терапевтических стратегий в этой области направлена на изучение возможности манипулирования сетью шаперонов в целом и влияния этой манипуляции на прогрессирование нейродегенеративных заболеваний, однако баланс уровней Hsp70 и Hsp90 представляется ключевым в этой патофизиологии.

При диабете

Колебания уровней шаперона HSP70 влияют на гомеостаз. Диабет приводит к развитию ряда микрососудистых заболеваний, таких как ретинопатия. Toll-подобные рецепторы являются неотъемлемой частью врожденной иммунной системы, и eHSP70 связывается с ними, активируя путь MyD88, что дополнительно стимулирует NF-κB, цитокины, такие как TNFα и IL-1β, и увеличивает выработку активных форм кислорода, способствуя развитию инсулинорезистентности и диабета. При этом наблюдается снижение уровня iHSP70.