Введение

Белок

Убиквитин-лигаза (также называемая E3-убиквитин-лигазой) – это белок, который привлекает конъюгирующий фермент E2, нагруженный убиквитином, распознает белковый субстрат и способствует или непосредственно катализирует перенос убиквитина с E2 на белковый субстрат. Проще говоря, лигаза обеспечивает перемещение убиквитина от носителя убиквитина к другому объекту (субстрату) посредством определенного механизма. Убиквитин, достигнув места назначения, в конечном итоге присоединяется изопептидной связью к остатку лизина, являющемуся частью целевого белка. E3-лигазы взаимодействуют как с целевым белком, так и с ферментом E2, тем самым придавая E2 специфичность к субстрату. Как правило, E3-лигазы полиубиквитинируют свой субстрат с помощью цепей убиквитина, связанных по Lys48, направляя субстрат на разрушение протеасомой. Однако возможны и другие типы связей, которые изменяют активность белка, его взаимодействия или локализацию. Убиквитинирование, осуществляемое E3-лигазами, регулирует различные процессы, такие как транспорт веществ в клетке, репарация ДНК и передача сигналов, и имеет огромное значение в клеточной биологии. E3-лигазы также играют ключевую роль в контроле клеточного цикла, опосредуя деградацию циклинов, а также белков-ингибиторов циклинзависимых киназ. Геном человека кодирует более 600 предполагаемых E3-лигаз, что обеспечивает огромное разнообразие субстратов.

Система убиквитинации

Убиквитин-лигаза называется E3 и функционирует совместно с E1 – ферментом, активирующим убиквитин, и E2 – ферментом, конъюгирующим убиквитин. Существует один основной фермент E1, общий для всех убиквитин-лигаз, который использует АТФ для активации убиквитина для конъюгации и передает его ферменту E2. Фермент E2 взаимодействует со специфическим партнером E3 и переносит убиквитин на целевой белок. E3, который может представлять собой мультипротеиновый комплекс, в целом отвечает за направление убиквитинации на специфические белки-субстраты. Реакция убиквитинации протекает в три или четыре этапа в зависимости от механизма действия убиквитин-лигазы E3. На первом, консервативном этапе, цистеиновый остаток E1 атакует C-концевой глицин убиквитина, активированный АТФ, в результате чего образуется тиоэстерный комплекс Ub-S-E1. Энергия, высвобождаемая при гидролизе АТФ и дифосфата, обеспечивает образование этого реактивного тиоэстера, а последующие этапы термонейтральны. Далее происходит реакция транстиоляции, в которой цистеиновый остаток E2 атакует и замещает E1. E3-лигазы с доменом HECT проводят еще одну реакцию транстиоляции для переноса молекулы убиквитина на E3, в то время как гораздо более распространенные E3-лигазы с доменом RING finger переносят убиквитин непосредственно из E2 на субстрат. Заключительным этапом первого события убиквитинации является атака аминогруппы лизина целевого белка, которая удаляет цистеин и формирует стабильную изопептидную связь. Одним из заметных исключений является белок p21, который, по-видимому, подвергается убиквитинации с использованием своей N-концевой аминогруппы, тем самым образуя пептидную связь с убиквитином.

Семейства убиквитиновых лигаз

У людей насчитывается, по оценкам, от 500 до 1000 E3-лигаз, которые определяют специфичность субстрата для E1 и E2. E3-лигазы классифицируются на четыре семейства: HECT, RING finger, U box и PHD finger. F-box белки содержат F-box, который связывает остальную часть комплекса SCF, и домен связывания субстрата, который придает E3 специфичность к субстрату. Убиквитин-сигнализация полагается на разнообразие убиквитинных меток для специфичности передаваемого сигнала. Белок может быть помечен одной молекулой убиквитина (моноубиквитилирование) или различными цепями молекул убиквитина (полиубиквитилирование). E3 убиквитин-лигазы катализируют события полиубиквитилирования аналогично механизму моноубиквитилирования, используя вместо этого лизиновый остаток из молекулы убиквитина, уже присоединенной к белку-субстрату, для атаки на C-конец новой молекулы убиквитина. Моноубиквитилирование также может регулировать локализацию цитозольных белков. Например, E3-лигаза MDM2 убиквитилирует p53 либо для деградации (K48-полиубиквитинная цепь), либо для экспорта в ядро (моноубиквитилирование). Эти события происходят в зависимости от концентрации, что позволяет предположить, что модуляция концентрации E3-лигазы является клеточной регуляторной стратегией для контроля белкового гомеостаза и локализации.

Опознание субстрата

Убиквитин-лигазы являются заключительным и, возможно, наиболее важным фактором, определяющим специфичность субстрата при убиквитинировании белков. Лигазы должны одновременно различать свой белковый субстрат среди тысяч других белков в клетке и среди других (убиквитинирование-неактивных) форм того же белка. Это достигается различными механизмами, большинство из которых связаны с распознаванием дегронов: специфических коротких аминокислотных последовательностей или химических мотивов на субстрате.

N-дегроны

Протеолитический расщепление может приводить к обнажению аминокислотных остатков на N-конце белка. Согласно правилу N-конца, различные N-концевые аминокислоты (или N-деграны) распознаются их соответствующей убиквитинлигазой (N-рекгнином) в разной степени, что влияет на период полураспада белка. Например, положительно заряженные (Arg, Lys, His) и объемные гидрофобные аминокислоты (Phe, Trp, Tyr, Leu, Ile) распознаются предпочтительно и, следовательно, считаются дестабилизирующими дегранами, поскольку они обеспечивают более быстрое расщепление соответствующих белков.

Фосфодегрены

Дегрон может быть преобразован в свою активную форму посредством посттрансляционной модификации, такой как фосфорилирование остатка тирозина, серина или треонина. В этом случае убиквитинлигаза распознает исключительно фосфорилированную версию субстрата благодаря стабилизации в области связывания. Например, FBW7, субстрат-распознающий модуль SCFFBW7-убиквитинлигазы, стабилизирует фосфорилированный субстрат, образуя водородные связи между своими аргининовыми остатками и фосфатной группой, как показано на рисунке справа. При отсутствии фосфата остатки FBW7 отталкивают субстрат. Другим примером контроля деградации белков малыми молекулами является фитогормон ауксин у растений. Ауксин связывается с TIR1 (доменом распознавания субстрата SCFTIR1-убиквитинлигазы), повышая аффинность TIR1 к своим субстратам (репрессорам транскрипции: Aux/IAA) и стимулируя их деградацию.

Неправильно сложенные и деградованные сахара

Помимо распознавания аминокислот, убиквитин-лигазы могут также обнаруживать необычные характеристики субстратов, служащие сигналами для их деградации. Эти домены распознавания содержат небольшие гидрофобные участки, позволяющие им связывать гликаны, содержащие большое количество маннозы.

Структурные мотивы

В дополнение к линейным дегранам, E3-лигаза в некоторых случаях может также распознавать структурные мотивы на субстрате. Например, мутация MDM2 была обнаружена при раке желудка, почечно-клеточном раке и раке печени (среди прочих), приводящая к дерегуляции концентрации MDM2 за счет повышения аффинности его промотора к транскрипционному фактору Sp1, что вызывает усиленную транскрипцию мРНК MDM2. К таким методам относятся идентификация биотина, зависящая от близости (BioID), захват субстратов убиквитин-лигаз и тандемные убиквитин-связывающие структуры (TUBEs).