Протеасомы и система убиквитин-протеасомы: деградация белков в клетке.

Введение

Белковые комплексы, которые разрушают ненужные или поврежденные белки посредством протеолиза.

Протеасомы – это белковые комплексы, которые разрушают ненужные или поврежденные белки посредством протеолиза, химической реакции, разрывающей пептидные связи. Ферменты, способствующие таким реакциям, называются протеазами. Протеасомы являются частью основного механизма, с помощью которого клетки регулируют концентрацию определенных белков и разрушают неправильно свернутые белки. Белки маркируются для деградации небольшим белком, называемым убиквитином. Реакция маркировки катализируется ферментами, называемыми убиквитин-лигазами. После того, как белок маркирован одной молекулой убиквитина, это служит сигналом для других лигаз присоединить дополнительные молекулы убиквитина. В результате образуется полиубиквитинная цепь, которая связывается с протеасомой, позволяя ей разрушать помеченный белок. Протеасомы обнаружены внутри всех эукариот и архей, а также в некоторых бактериях. У эукариот протеасомы расположены как в ядре, так и в цитоплазме. По структуре протеасома представляет собой цилиндрический комплекс, содержащий «ядро» из четырех сложенных колец, формирующих центральную пору. Каждое кольцо состоит из семи отдельных белков. Внутренние два кольца состоят из семи β-субъединиц, содержащих от трех до семи активных центров протеазы. Эти центры расположены на внутренней поверхности колец, поэтому целевой белок должен войти в центральную пору, прежде чем он будет разрушен. Внешние два кольца содержат по семь α-субъединиц, функция которых заключается в поддержании «воротных» структур, через которые белки входят в цилиндр. Эти α-субъединицы контролируются связыванием со структурами «крышек» или регуляторными частицами, которые распознают полиубиквитиновые метки, прикрепленные к белковым субстратам, и инициируют процесс деградации. Вся система убиквитинирования и протеасомальной деградации известна как система убиквитин-протеасомы. Путь протеасомальной деградации необходим для многих клеточных процессов, включая клеточный цикл, регуляцию экспрессии генов и ответ на окислительный стресс. Важность протеолитического расщепления внутри клеток и роль убиквитина в протеолитических путях была отмечена присуждением Нобелевской премии по химии 2004 года Аарону Сиечановеру, Авраму Хершко и Ирвину Роузу.

Proteasomes are protein complexes which degrade unneeded or damaged proteins by proteolysis, a chemical reaction that breaks peptide bonds. Enzymes that help such reactions are called proteases. Proteasomes are part of a major mechanism by which cells regulate the concentration of particular proteins and degrade misfolded proteins. Proteins are tagged for degradation with a small protein called ubiquitin. The tagging reaction is catalyzed by enzymes called ubiquitin ligases. Once a protein is tagged with a single ubiquitin molecule, this is a signal to other ligases to attach additional ubiquitin molecules. The result is a polyubiquitin chain that is bound by the proteasome, allowing it to degrade the tagged protein. Proteasomes are found inside all eukaryotes and archaea, and in some bacteria. In eukaryotes, proteasomes are located both in the nucleus and in the cytoplasm. In structure, the proteasome is a cylindrical complex containing a "core" of four stacked rings forming a central pore. Each ring is composed of seven individual proteins. The inner two rings are made of seven β subunits that contain three to seven protease active sites. These sites are located on the interior surface of the rings, so that the target protein must enter the central pore before it is degraded. The outer two rings each contain seven α subunits whose function is to maintain a "gate" through which proteins enter the barrel. These α subunits are controlled by binding to "cap" structures or regulatory particles that recognize polyubiquitin tags attached to protein substrates and initiate the degradation process. The overall system of ubiquitination and proteasomal degradation is known as the ubiquitin–proteasome system. The proteasomal degradation pathway is essential for many cellular processes, including the cell cycle, the regulation of gene expression, and responses to oxidative stress. The importance of proteolytic degradation inside cells and the role of ubiquitin in proteolytic pathways was acknowledged in the award of the 2004 Nobel Prize in Chemistry to Aaron Ciechanover, Avram Hershko and Irwin Rose.

Открытие

До открытия системы убиквитин-протеазомы считалось, что деградация белков в клетках зависит в основном от лизосом – мембранных органелл с кислым содержимым, богатым протеазами, способных расщеплять и затем перерабатывать экзогенные белки, а также стареющие или поврежденные органеллы. В 1978 году было показано, что этот комплекс состоит из нескольких различных белковых цепей, что было новым словом в протеазной химии на тот момент. Последующие исследования модификации гистонов привели к обнаружению неожиданной ковалентной модификации белка гистона посредством связи между лизиновым радикалом гистона и C-концевым глициновым остатком убиквитина – белка, функция которого ранее была неизвестна. Вскоре выяснилось, что ранее идентифицированный белок, связанный с протеолитической деградацией и известный как фактор протеолиза, зависимый от АТФ 1 (APF 1), является идентичным убиквитину. Протеолитическая активность этой системы была выделена в виде мультипротеинового комплекса, первоначально названного мультикаталитическим протеиназным комплексом Шервином Уилком и Марион Орловски. Позже был обнаружен протеолитический комплекс, зависимый от АТФ, ответственный за деградацию белков, зависящую от убиквитина, и названный 26S-протеазомой. Большая часть ранних работ, приведших к открытию системы убиквитин-протеазомы, была проведена в конце 1970-х и начале 1980-х годов в Технионе, в лаборатории Аврама Гершко, где Аарон Сиечановер работал аспирантом. Годовая стажировка Гершко в лаборатории Ирвина Роуза в онкологическом центре Фокс Чейз предоставила ключевые концептуальные идеи, хотя Роуз впоследствии принизил свою роль в этом открытии. В 2004 году они были удостоены Нобелевской премии по химии за открытие этой системы. Первая структура частицы ядра протеасомы была определена методом рентгеновской кристаллографии только в 1994 году. В 2018 году первые атомные структуры голофермента протеасомы 26S человека в комплексе с полиубиквитилированным белковым субстратом были определены с помощью криоэлектронной микроскопии, что позволило раскрыть механизмы, посредством которых субстрат распознается, деубиквитилируется, разворачивается и деградируется протеасомой 26S человека.

Before the discovery of the ubiquitin–proteasome system, protein degradation in cells was thought to rely mainly on lysosomes, membrane bound organelles with acidic and protease filled interiors that can degrade and then recycle exogenous proteins and aged or damaged organelles. This was shown in 1978 to be composed of several distinct protein chains, a novelty among proteases at the time. Later work on modification of histones led to the identification of an unexpected covalent modification of the histone protein by a bond between a lysine side chain of the histone and the C terminal glycine residue of ubiquitin, a protein that had no known function. It was then discovered that a previously identified protein associated with proteolytic degradation, known as ATP dependent proteolysis factor 1 (APF 1), was the same protein as ubiquitin. The proteolytic activities of this system were isolated as a multi protein complex originally called the multi catalytic proteinase complex by Sherwin Wilk and Marion Orlowski. Later, the ATP dependent proteolytic complex that was responsible for ubiquitin dependent protein degradation was discovered and was called the 26S proteasome. Much of the early work leading up to the discovery of the ubiquitin proteasome system occurred in the late 1970s and early 1980s at the Technion in the laboratory of Avram Hershko, where Aaron Ciechanover worked as a graduate student. Hershko's year long sabbatical in the laboratory of Irwin Rose at the Fox Chase Cancer Center provided key conceptual insights, though Rose later downplayed his role in the discovery. The three shared the 2004 Nobel Prize in Chemistry for their work in discovering this system. the first structure of the proteasome core particle was not solved by X ray crystallography until 1994. In 2018, the first atomic structures of the human 26S proteasome holoenzyme in complex with a polyubiquitylated protein substrate were solved by cryogenic electron microscopy, revealing mechanisms by which the substrate is recognized, deubiquitylated, unfolded and degraded by the human 26S proteasome.

Структура и организация

Подкомпоненты протеасомы часто обозначаются их коэффициентом седиментации Сведберга (обозначается S). Наиболее часто используемая у млекопитающих протеасома – цитозольная 26S протеасома, молекулярная масса которой составляет около 2000 килодальтонов (кДа) и которая содержит одну 20S белковую субъединицу и две 19S регуляторные капсульные субъединицы. Ядро имеет полость и обеспечивает замкнутое пространство, в котором происходит деградация белков; отверстия на обоих концах ядра позволяют целевому белку проникать внутрь. Каждый конец частицы ядра связан с 19S регуляторной субъединицей, содержащей множественные активные центры АТФазы и участки связывания убиквитина; именно эта структура распознает полиубиквитинированные белки и транспортирует их в каталитическое ядро.

20S частица ядра

Количество и разнообразие субъединиц, содержащихся в частице ядра 20S, зависит от организма; число различных и специализированных субъединиц больше у многоклеточных организмов, чем у одноклеточных, и больше у эукариотов, чем у прокариотов. Все частицы 20S состоят из четырех сложенных в стопку гептамерных кольцевых структур, которые сами состоят из двух различных типов субъединиц; α-субъединицы имеют структурную функцию, в то время как β-субъединицы преимущественно каталитические. α-субъединицы являются псевдоферментами, гомологичными β-субъединицам. Они собираются, располагая свои N-концы рядом с N-концами β-субъединиц. Внутренние два кольца состоят из семи β-субъединиц, и в их N-концах содержатся активные центры протеазы, осуществляющие реакции протеолиза. В очищенном комплексе были идентифицированы три различных каталитических активности: химотрипсин-подобная, трипсин-подобная и пептидилглутамилпептидная гидролизная. Размер протеасомы относительно консервативен и составляет примерно 150 ангстрем (Å) на 115 Å. Внутренняя камера имеет ширину не более 53 Å, хотя вход может быть узким, как 13 Å, что позволяет предположить, что белки-субстраты должны быть по крайней мере частично развернуты, чтобы проникнуть внутрь. У архей, таких как Thermoplasma acidophilum, все α- и все β-субъединицы идентичны, в то время как эукариотические протеасомы, например, в дрожжах, содержат семь различных типов каждой субъединицы. У млекопитающих субъединицы β1, β2 и β5 являются каталитическими; хотя они имеют общий механизм, они обладают тремя различными специфичностями к субстратам, которые классифицируются как химотрипсин-подобная, трипсин-подобная и пептидилглутамилпептидная гидролизная (PHGH). Альтернативные формы β, обозначаемые β1i, β2i и β5i, могут экспрессироваться в гемопоэтических клетках в ответ на воздействие провоспалительных сигналов, таких как цитокины, в частности, интерферон гамма. Протеасома, собранная с этими альтернативными субъединицами, известна как иммунопротеасома, специфичность субстрата которой изменена по сравнению с нормальной протеасомой. Эти протеасомы (известные как α4α4 протеасомы) вместо этого формируют частицы ядра 20S, содержащие дополнительную α4-субъединицу вместо отсутствующей α3-субъединицы. Эти альтернативные "α4α4" протеасомы ранее были обнаружены у дрожжей. Хотя точная функция этих изоформ протеасомы до сих пор в значительной степени неизвестна, клетки, экспрессирующие эти протеасомы, демонстрируют повышенную устойчивость к токсичности, вызванной ионами металлов, таких как кадмий.

The number and diversity of subunits contained in the 20S core particle depends on the organism; the number of distinct and specialized subunits is larger in multicellular than unicellular organisms and larger in eukaryotes than in prokaryotes. All 20S particles consist of four stacked heptameric ring structures that are themselves composed of two different types of subunits; α subunits are structural in nature, whereas β subunits are predominantly catalytic. The α subunits are pseudoenzymes homologous to β subunits. They are assembled with their N termini adjacent to that of the β subunits. The inner two rings each consist of seven β subunits and in their N termini contain the protease active sites that perform the proteolysis reactions. Three distinct catalytic activities were identified in the purified complex: chymotrypsin like, trypsin like and peptidylglutamyl peptide hydrolyzing. The size of the proteasome is relatively conserved and is about 150 angstroms (Å) by 115 Å. The interior chamber is at most 53 Å wide, though the entrance can be as narrow as 13 Å, suggesting that substrate proteins must be at least partially unfolded to enter. In archaea such as Thermoplasma acidophilum, all the α and all the β subunits are identical, whereas eukaryotic proteasomes such as those in yeast contain seven distinct types of each subunit. In mammals, the β1, β2, and β5 subunits are catalytic; although they share a common mechanism, they have three distinct substrate specificities considered chymotrypsin like, trypsin like, and peptidyl glutamyl peptide hydrolyzing (PHGH). Alternative β forms denoted β1i, β2i, and β5i can be expressed in hematopoietic cells in response to exposure to pro inflammatory signals such as cytokines, in particular, interferon gamma. The proteasome assembled with these alternative subunits is known as the immunoproteasome, whose substrate specificity is altered relative to the normal proteasome. These proteasomes (known as the α4 α4 proteasomes) instead form 20S core particles containing an additional α4 subunit in place of the missing α3 subunit. These alternative 'α4 α4' proteasomes have been known previously to exist in yeast. Although the precise function of these proteasome isoforms is still largely unknown, cells expressing these proteasomes show enhanced resistance to toxicity induced by metallic ions such as cadmium.

19S регуляторная частица

Частица 19S в эукариотических организмах состоит из 19 отдельных белков и делится на два подкомплекса: основание из 9 субъединиц, которое связывается непосредственно с α-кольцом частицы ядра 20S, и крышку из 10 субъединиц. Шесть из девяти базовых белков являются АТФазными субъединицами из семейства AAA, и эволюционный гомолог этих АТФаз существует у архей, называемый PAN (протеасом-активирующая нуклеотидаза). Для ассоциации частиц 19S и 20S требуется связывание АТФ с 19S-АТФазными субъединицами, а гидролиз АТФ необходим для деградации свернутых и убиквитинированных белков собранным комплексом. Важно отметить, что только этап разворачивания субстрата требует энергии от гидролиза АТФ, в то время как связывание АТФ само по себе может поддерживать все остальные этапы, необходимые для деградации белка (например, сборку комплекса, открытие ворот, транслокацию и протеолиз). В 2012 году две независимые группы выяснили молекулярную архитектуру протеасомы 26S с помощью электронной микроскопии отдельных частиц. В 2016 году три независимые группы определили первую структуру человеческой 26S протеасомы с почти атомным разрешением в отсутствие субстратов с помощью криоэлектронной микроскопии. В 2018 году масштабные усилия позволили выяснить детальные механизмы деубиквитинирования, инициирования транслокации и процессивного разворачивания субстратов путем одновременного определения семи атомных структур протеасомы 26S, связанной с субстратом. Характерной чертой конфигурации AAA-АТФазы в этом преобладающем состоянии с низкой энергией является лестничное или шайбоподобное расположение AAA-доменов. Некоторые конформации, связанные с субстратом, имеют высокую степень сходства со свободными от субстрата, но они не полностью идентичны, особенно в AAA-АТФазном модуле. Примечательно, что все эти конформеры несколько отличаются и обладают различными особенностями. Таким образом, регуляторная частица 19S может принимать по крайней мере 20 конформационных состояний в различных физиологических условиях. [[Файл:3 конформационных состояния 26S протеазомы. jpg|thumb|300px|Три различных конформационных состояния 26S протеасомы. Механизм, с помощью которого протеасомная АТФаза открывает эти ворота, был недавно выяснен. Механизмы, с помощью которых она связывается с основной частицей через C-концевые хвосты своих субъединиц и индуцирует конформационные изменения α-кольца для открытия 20S-ворот, предполагают аналогичный механизм для частицы 19S. Экспрессия частицы 11S индуцируется интерфероном гамма и, в сочетании с β-субъединицами иммунопротеасомы, отвечает за генерацию пептидов, которые связываются с основным комплексом гистосовместимости. Сборка полупротеасом, в свою очередь, инициируется сборкой α-субъединиц в их гептамерное кольцо, формируя матрицу для ассоциации соответствующего pro β-кольца. Сборка α-субъединиц не была охарактеризована. Только недавно процесс сборки регуляторной частицы 19S был в значительной степени прояснен. Регуляторная частица 19S собирается в виде двух отдельных подкомпонентов: основания и крышки. Сборку базового комплекса облегчают четыре шаперона: Hsm3/S5b, Nas2/p27, Rpn14/PAAF1 и Nas6/gankyrin (названия для дрожжей/млекопитающих). Эти шапероны сборки связываются с ААА-АТФазными субъединицами, и их основная функция, по-видимому, заключается в обеспечении правильной сборки гетерогексамерного AAA-АТФазного кольца. На сегодняшний день все еще обсуждается, собирается ли базовый комплекс отдельно, является ли сборка матрицей для частицы ядра 20S или существуют ли альтернативные пути сборки. В дополнение к четырем шаперонам сборки, деубиквитинирующий фермент Ubp6/Usp14 также способствует сборке основания, но он не является существенным. Крышка собирается отдельно в определенном порядке и не требует шаперонов сборки.

The 19S particle in eukaryotes consists of 19 individual proteins and is divisible into two subassemblies, a 9 subunit base that binds directly to the α ring of the 20S core particle, and a 10 subunit lid. Six of the nine base proteins are ATPase subunits from the AAA Family, and an evolutionary homolog of these ATPases exists in archaea, called PAN (proteasome activating nucleotidase). The association of the 19S and 20S particles requires the binding of ATP to the 19S ATPase subunits, and ATP hydrolysis is required for the assembled complex to degrade folded and ubiquitinated proteins. Note that only the step of substrate unfolding requires energy from ATP hydrolysis, while ATP binding alone can support all the other steps required for protein degradation (e. g., complex assembly, gate opening, translocation, and proteolysis). In 2012, two independent efforts have elucidated the molecular architecture of the 26S proteasome by single particle electron microscopy. In 2016, three independent efforts have determined the first near atomic resolution structure of the human 26S proteasome in the absence of substrates by cryo EM. In 2018, a major effort has elucidated the detailed mechanisms of deubiquitylation, initiation of translocation and processive unfolding of substrates by determining seven atomic structures of substrate engaged 26S proteasome simultaneously. A hallmark of the AAA ATPase configuration in this predominant low energy state is a staircase or lockwasher like arrangement of the AAA domains. Some of the substrate bound conformations bear high similarity to the substrate free ones, but they are not entirely identical, particularly in the AAA ATPase module. Notably, all these conformers are somewhat different and present distinct features. Thus, the 19S regulatory particle can sample at least 20 conformational states under different physiological conditions. [[File:3 conformational states of 26S proteasome. jpg|thumb|300px|Three distinct conformational states of the 26S proteasome. The mechanism by which the proteasomal ATPase open this gate has been recently elucidated. The mechanisms by which it binds to the core particle through the C terminal tails of its subunits and induces α ring conformational changes to open the 20S gate suggest a similar mechanism for the 19S particle. The expression of the 11S particle is induced by interferon gamma and is responsible, in conjunction with the immunoproteasome β subunits, for the generation of peptides that bind to the major histocompatibility complex. The assembly of the half proteasomes, in turn, is initiated by the assembly of the α subunits into their heptameric ring, forming a template for the association of the corresponding pro β ring. The assembly of α subunits has not been characterized. Only recently, the assembly process of the 19S regulatory particle has been elucidated to considerable extent. The 19S regulatory particle assembles as two distinct subcomponents, the base and the lid. Assembly of the base complex is facilitated by four assembly chaperones, Hsm3/S5b, Nas2/p27, Rpn14/PAAF1, and Nas6/gankyrin (names for yeast/mammals). These assembly chaperones bind to the AAA ATPase subunits and their main function seems to be to ensure proper assembly of the heterohexameric AAA ATPase ring. To date it is still under debate whether the base complex assembles separately, whether the assembly is templated by the 20S core particle, or whether alternative assembly pathways exist. In addition to the four assembly chaperones, the deubiquitinating enzyme Ubp6/Usp14 also promotes base assembly, but it is not essential. The lid assembles separately in a specific order and does not require assembly chaperones.

Деубиквитализация

Убиквитинные цепи, конъюгированные с белком, предназначенным для протеасомального разложения, обычно удаляются одним из трех деубиквитилирующих ферментов (DUB), связанных с протеасомой: Rpn11, Ubp6/USP14 и UCH37. Этот процесс рециркулирует убиквитин и необходим для поддержания пула убиквитина в клетках. Похоже, что USP14 регулирует функцию протеасомы на нескольких контрольных точках, как каталитически конкурируя с Rpn11, так и аллостерически перепрограммируя состояния AAA-АТФазы, что довольно неожиданно для DUB. То, какой из этих процессов является лимитирующей стадией в общей реакции протеолиза, зависит от конкретного субстрата: для некоторых белков лимитирующей стадией является процесс разворачивания, а для других – деубиквитинирование. Также было предложено, что наличие внутринне неупорядоченных белковых сегментов достаточного размера, расположенных либо на конце белка, либо внутри него, может способствовать эффективному инициированию деградации. «Ворота», образованные α-субъединицами, предотвращают проникновение пептидов длиной более четырех аминокислотных остатков во внутреннюю часть 20S-частицы. Молекулы АТФ, связанные до этапа начального распознавания, гидролизуются перед транслокацией. Хотя энергия необходима для разворачивания субстрата, она не требуется для транслокации. Механизм разворачивания глобулярных белков должен быть общим, но в некоторой степени зависит от аминокислотной последовательности. Показано, что длинные последовательности чередующихся глицина и аланина ингибируют разворачивание субстрата, снижая эффективность протеасомальной деградации; это приводит к высвобождению частично деградированных продуктов, возможно, из-за разъединения гидролиза АТФ и разворачивания. Подобные повторы глицин-аланина встречаются и в природе, например, в шелковом фиброине; в частности, некоторые продукты гена вируса Эпштейна-Барр, содержащие эту последовательность, могут блокировать протеасому, способствуя распространению вируса путем предотвращения презентации антигена на главном комплексе гистосовместимости. Разрез частицы ядра протеасомы 20S, иллюстрирующий расположение активных центров. α-субъединицы представлены зелеными сферами, а β-субъединицы – белковыми остовами, окрашенными в отдельные полипептидные цепи. Маленькие розовые сферы обозначают положение остатка треонина в активном центре каждой субъединицы. Светло-синие химические структуры – ингибитор бортезомиб, связанный с активными центрами.

Ubiquitin chains conjugated to a protein targeted for proteasomal degradation are normally removed by any one of the three proteasome associated deubiquitylating enzymes (DUBs), which are Rpn11, Ubp6/USP14 and UCH37. This process recycles ubiquitin and is essential to maintain the ubiquitin reservoir in cells. It appears that USP14 regulates proteasome function at multiple checkpoints by both catalytically competing with Rpn11 and allosterically reprogramming the AAA ATPase states, which is rather unexpected for a DUB. Which of these processes is the rate limiting step in the overall proteolysis reaction depends on the specific substrate; for some proteins, the unfolding process is rate limiting, while deubiquitination is the slowest step for other proteins. The presence of intrinsically disordered protein segments of sufficient size, either at the protein terminus or internally, has also been proposed to facilitate efficient initiation of degradation. The gate formed by the α subunits prevents peptides longer than about four residues from entering the interior of the 20S particle. The ATP molecules bound before the initial recognition step are hydrolyzed before translocation. While energy is needed for substrate unfolding, it is not required for translocation. The mechanism for unfolding of globular proteins is necessarily general, but somewhat dependent on the amino acid sequence. Long sequences of alternating glycine and alanine have been shown to inhibit substrate unfolding, decreasing the efficiency of proteasomal degradation; this results in the release of partially degraded byproducts, possibly due to the decoupling of the ATP hydrolysis and unfolding steps. Such glycine alanine repeats are also found in nature, for example in silk fibroin; in particular, certain Epstein–Barr virus gene products bearing this sequence can stall the proteasome, helping the virus propagate by preventing antigen presentation on the major histocompatibility complex. thumb|200px|left|A cutaway view of the proteasome 20S core particle illustrating the locations of the active sites. The α subunits are represented as green spheres and the β subunits as protein backbones colored by individual polypeptide chain. The small pink spheres represent the location of the active site threonine residue in each subunit. Light blue chemical structures are the inhibitor bortezomib bound to the active sites.

Протеолиз

Протеазома функционирует как эндопротеаза. Механизм протеолиза β-субъединицами 20S-частицы происходит посредством нуклеофильной атаки, зависимой от треонина. Этот механизм может зависеть от ассоциированной молекулы воды для депротонирования реактивного гидроксила треонина. Деградация происходит в центральной камере, образованной ассоциацией двух β-колец, и обычно не приводит к высвобождению частично деградированных продуктов, а субстрат расщепляется до коротких полипептидов, обычно длиной 7–9 аминокислотных остатков, хотя их длина может варьироваться от 4 до 25 остатков в зависимости от организма и субстрата. Биохимический механизм, определяющий длину продуктов, изучен не полностью. Хотя три каталитические β-субъединицы имеют общий механизм, они обладают несколько различающейся специфичностью к субстрату, которая характеризуется как химотрипсиноподобная, трипсиноподобная и пептидилглутамилпептидгидролизующая (PHGH). Эти различия в специфичности обусловлены межмолекулярными контактами с локальными аминокислотными остатками вблизи активных центров каждой субъединицы. Каждая каталитическая β-субъединица также содержит консервативный остаток лизина, необходимый для протеолиза. Подобные эффекты наблюдаются и у белков дрожжей; этот механизм селективной деградации известен как регулируемая обработка, зависимая от убиквитина и протеазомы (RUP).

Деградация, не зависящая от убиквитина

Хотя большинство протеасомальных субстратов должны быть убиквитинированы перед деградацией, существуют исключения из этого общего правила, особенно когда протеасома выполняет нормальную функцию в посттрансляционной обработке белка. Ярким примером является протеасомальная активация NF κB посредством процессинга p105 в p50 через внутренний протеолиз. Некоторые белки деградируют независимо от убиквитина. Наиболее известным примером субстрата протеазомы, не требующего убиквитинирования, является фермент орнитиндекарбоксилаза. Также сообщалось о механизмах, независимых от убиквитина, нацеленных на ключевых регуляторов клеточного цикла, таких как p53, хотя p53 также подвергается деградации, зависимой от убиквитина. Наконец, структурно аномальные, неправильно свернутые или сильно окисленные белки также подвергаются деградации, не зависящей от убиквитина и 19S-комплекса, в условиях клеточного стресса.

Эволюция

Составленный комплекс hslV (синий) и hslU (красный) из *E. coli*. Считается, что этот комплекс белков теплового шока напоминает предка современной протеасомы. Протеасома 20S является повсеместной и необходимой у эукариот и архей. Бактериальный порядок Actinomycetales также обладает гомологами протеасомы 20S, в то время как большинство бактерий несут гены теплового шока *hslV* и *hslU*, продукты которых представляют собой мультимерную протеазу, организованную в двухслойное кольцо, и АТФазу. Предполагается, что белок HslV похож на вероятного предка протеасомы 20S. В целом, HslV не является жизненно важным для бактерий, и не все бактерии им обладают, тогда как некоторые протисты обладают как 20S, так и hslV системами. В клетках позвоночных "проскальзывание" через митотическую контрольную точку, приводящее к преждевременному выходу в фазу M, может происходить, несмотря на задержку этого выхода контрольной точкой веретена деления. Более ранние контрольные точки клеточного цикла, такие как контрольная точка после точки ограничения между фазами G1 и S, также включают протеасомную деградацию циклинов A, убиквитинирование которого стимулируется анафазопродвигающим комплексом (APC) – E3 убиквитинлигазой. APC и комплекс Skp1/Cul1/F-box белка (SCF-комплекс) являются двумя ключевыми регуляторами деградации циклинов и контроля контрольных точек; сам SCF регулируется APC посредством убиквитинирования адапторного белка Skp2, что предотвращает активность SCF до перехода G1-S. Отдельные компоненты частицы 19S выполняют собственные регуляторные функции. Ганкирин, недавно идентифицированный онкопротеин, является одним из субкомпонентов 19S, который также тесно связывается с циклинзависимой киназой CDK4 и играет ключевую роль в распознавании убиквитинированного p53 благодаря своему сродству к убиквитинлигазе MDM2. Ганкирин обладает антиапоптотическим действием и, как показано, сверхэкспрессируется в некоторых типах опухолевых клеток, таких как гепатоцеллюлярная карцинома. Подобно эукариотам, некоторые археи также используют протеасому для контроля клеточного цикла, в частности, контролируя клеточное деление, опосредованное ESCRT III.

Регулирование роста растений

В растениях сигнализация ауксинами, или фитогормонами, определяющими направление и тропизм роста растений, вызывает нацеливание на протеасомальную деградацию класса репрессоров факторов транскрипции, известных как белки Aux/IAA. Эти белки убиквитинируются SCFTIR1, или SCF в комплексе с ауксиновым рецептором TIR1. Деградация белков Aux/IAA снимает репрессию с факторов транскрипции семейства факторов ответа на ауксин (ARF) и индуцирует экспрессию генов, регулируемую ARF. Клеточные последствия активации ARF зависят от типа растения и стадии развития, но участвуют в направлении роста корней и листовых жилок. Считается, что специфический ответ на дерепрессию ARF опосредован специфичностью взаимодействия отдельных белков ARF и Aux/IAA.

Апоптоз

Как внутренние, так и внешние сигналы могут приводить к индукции апоптоза, или запрограммированной гибели клеток. Последующая деконструкция клеточных компонентов в основном осуществляется специализированными протеазами, известными как каспазы, однако протеасома также играет важную и разнообразную роль в апоптотическом процессе. О вовлеченности протеасомы в этот процесс свидетельствует как увеличение убиквитинирования белков, так и повышение активности ферментов E1, E2 и E3, наблюдаемое задолго до начала апоптоза. В ходе апоптоза также наблюдается транслокация протеасом, локализованных в ядре, к внешним мембранным выпячиваниям, характерным для апоптоза. Ингибирование протеасомы оказывает различное влияние на индукцию апоптоза в разных типах клеток. В целом, протеасома не является необходимой для апоптоза, хотя ее ингибирование в большинстве исследованных типов клеток проявляет проапоптотический эффект. Апоптоз опосредован нарушением регулируемой деградации белков, стимулирующих клеточный цикл и рост. Способность ингибиторов протеасомы индуцировать апоптоз в быстро делящихся клетках была использована при разработке нескольких новых химиотерапевтических препаратов, таких как бортезомиб и салиноспорамид А.

Реакция на клеточный стресс

В ответ на клеточные стрессы, такие как инфекция, тепловой шок или окислительное повреждение, экспрессируются белки теплового шока, которые идентифицируют неправильно свернутые или развернутые белки и направляют их на протеасомальную деградацию. Как Hsp27, так и Hsp90 – белки-шапероны – были вовлечены в повышение активности системы убиквитин-протеасомы, хотя они не являются прямыми участниками этого процесса. Hsp70, напротив, связывается с открытыми гидрофобными участками на поверхности неправильно свернутых белков и рекрутирует E3 убиквитин-лигазы, такие как CHIP, для мечения белков для протеасомальной деградации. Белок CHIP (карбоксильный конец Hsp70-взаимодействующего белка) сам регулируется путем ингибирования взаимодействия между E3-ферментом CHIP и его E2-партнером по связыванию. Схожие механизмы существуют для стимуляции деградации окислительно поврежденных белков посредством системы протеасом. В частности, протеасомы, локализованные в ядре, регулируются PARP и активно разрушают неадекватно окисленные гистоны. Окисленные белки, которые часто образуют крупные аморфные агрегаты в клетке, могут быть разграждены непосредственно 20S-частицей без 19S-регуляторного комплекса и не требуют гидролиза АТФ или мечения убиквитином. Дисрегуляция системы убиквитин-протеасомы может способствовать развитию ряда нейрологических заболеваний. Это может приводить к опухолям мозга, таким как астроцитомы. В некоторых поздних нейродегенеративных заболеваниях, характеризующихся агрегацией неправильно свернутых белков, таких как болезнь Паркинсона и болезнь Альцгеймера, могут образовываться крупные нерастворимые агрегаты неправильно свернутых белков, вызывающие нейротоксичность посредством механизмов, которые пока недостаточно изучены. Снижение активности протеасомы было предложено в качестве причины агрегации и образования тел Леви при болезни Паркинсона. Эта гипотеза подтверждается тем, что дрожжевые модели болезни Паркинсона более чувствительны к токсичности α-синуклеина, основного белкового компонента тел Леви, в условиях низкой активности протеасомы. Нарушение протеасомальной активности может лежать в основе когнитивных расстройств, таких как расстройства аутистического спектра, а также мышечных и нервных заболеваний, таких как инклюзионная миопатия тела. Прочность связывания лигандов MHC класса I зависит от состава C-конца лиганда, поскольку пептиды связываются посредством водородных связей и тесных контактов с областью, называемой "B-карман" на поверхности MHC. Многие аллели MHC класса I предпочитают гидрофобные C-концевые остатки, и иммунопротеасомный комплекс с большей вероятностью генерирует гидрофобные C-концы. В связи со своей ролью в генерации активированной формы NFκB, антиапоптотического и провоспалительного регулятора экспрессии цитокинов, протеасомальная активность связана с воспалительными и аутоиммунными заболеваниями. Повышенные уровни протеасомальной активности коррелируют с активностью заболевания и были вовлечены в аутоиммунные заболевания, включая системную красную волчанку и ревматоидный артрит.

In response to cellular stresses – such as infection, heat shock, or oxidative damage – heat shock proteins that identify misfolded or unfolded proteins and target them for proteasomal degradation are expressed. Both Hsp27 and Hsp90—chaperone proteins have been implicated in increasing the activity of the ubiquitin proteasome system, though they are not direct participants in the process. Hsp70, on the other hand, binds exposed hydrophobic patches on the surface of misfolded proteins and recruits E3 ubiquitin ligases such as CHIP to tag the proteins for proteasomal degradation. The CHIP protein (carboxyl terminus of Hsp70 interacting protein) is itself regulated via inhibition of interactions between the E3 enzyme CHIP and its E2 binding partner. Similar mechanisms exist to promote the degradation of oxidatively damaged proteins via the proteasome system. In particular, proteasomes localized to the nucleus are regulated by PARP and actively degrade inappropriately oxidized histones. Oxidized proteins, which often form large amorphous aggregates in the cell, can be degraded directly by the 20S core particle without the 19S regulatory cap and do not require ATP hydrolysis or tagging with ubiquitin. Dysregulation of the ubiquitin proteasome system may contribute to several neural diseases. It may lead to brain tumors such as astrocytomas. In some of the late onset neurodegenerative diseases that share aggregation of misfolded proteins as a common feature, such as Parkinson's disease and Alzheimer's disease, large insoluble aggregates of misfolded proteins can form and then result in neurotoxicity, through mechanisms that are not yet well understood. Decreased proteasome activity has been suggested as a cause of aggregation and Lewy body formation in Parkinson's. This hypothesis is supported by the observation that yeast models of Parkinson's are more susceptible to toxicity from α synuclein, the major protein component of Lewy bodies, under conditions of low proteasome activity. Impaired proteasomal activity may underlie cognitive disorders such as the autism spectrum disorders, and muscle and nerve diseases such as inclusion body myopathy. The strength of MHC class I ligand binding is dependent on the composition of the ligand C terminus, as peptides bind by hydrogen bonding and by close contacts with a region called the "B pocket" on the MHC surface. Many MHC class I alleles prefer hydrophobic C terminal residues, and the immunoproteasome complex is more likely to generate hydrophobic C termini. Due to its role in generating the activated form of NF κB, an anti apoptotic and pro inflammatory regulator of cytokine expression, proteasomal activity has been linked to inflammatory and autoimmune diseases. Increased levels of proteasome activity correlate with disease activity and have been implicated in autoimmune diseases including systemic lupus erythematosus and rheumatoid arthritis.

Клиническое значение

Протеасома и ее субъединицы имеют клиническое значение по крайней мере по двум причинам: (1) нарушение сборки комплекса или дисфункция протеасомы могут быть связаны с патофизиологией конкретных заболеваний, и (2) они могут быть использованы в качестве мишеней для лекарственных препаратов при терапевтических вмешательствах. В последнее время уделяется больше внимания изучению протеасомы для разработки новых диагностических маркеров и стратегий. Углубленное и всестороннее понимание патофизиологии протеасомы должно привести к клиническим применениям в будущем. Протеасомы являются ключевым компонентом системы убиквитин-протеазомы (UPS) и соответствующего клеточного контроля качества белков (PQC). Убиквитинирование белков и последующий протеолиз и деградация протеасомой – важные механизмы регуляции клеточного цикла, роста и дифференцировки клеток, транскрипции генов, передачи сигналов и апоптоза. Дефекты протеасом приводят к снижению протеолитической активности и накоплению поврежденных или неправильно свернутых белков, что может способствовать развитию нейродегенеративных заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, воспалительных реакций и аутоиммунных заболеваний, а также системных повреждений ДНК, приводящих к злокачественным новообразованиям. Исследования выявили связь дефектов UPS с патогенезом нейродегенеративных и миодегенеративных расстройств, включая болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь Пика, боковой амиотрофический склероз (БАС) и заболевания двигательных нейронов, полиглутаминные (PolyQ) заболевания, мышечные дистрофии и ряд редких форм нейродегенеративных заболеваний, связанных с деменцией. Как часть системы убиквитин-протеазомы (UPS), протеасома поддерживает гомеостаз белков в сердце и, следовательно, играет важную роль при ишемическом повреждении сердца, гипертрофии желудочков и сердечной недостаточности. Кроме того, накапливаются данные о существенной роли UPS в злокачественной трансформации. Протеолиз, осуществляемый UPS, играет важную роль в ответах раковых клеток на стимулирующие сигналы, критически важные для развития рака. Соответственно, экспрессия генов посредством деградации факторов транскрипции, таких как p53, c-jun, c-Fos, NFκB, c-Myc, HIF1α, MATα2, STAT3, белки, связывающиеся со стерол-регулируемыми элементами, и андрогенные рецепторы, контролируется UPS и, таким образом, участвует в развитии различных злокачественных новообразований. Более того, UPS регулирует деградацию продуктов генов-супрессоров опухолей, таких как аденоматозный полипоз толстой кишки (APC) при колоректальном раке, ретинобластома (Rb) и опухолевого супрессора фон Гиппеля-Линдау (VHL), а также ряда протоонкогенов (Raf, Myc, Myb, Rel, Src, Mos, ABL). UPS также участвует в регуляции воспалительных реакций. Эта активность обычно объясняется ролью протеасом в активации NFκB, которая, в свою очередь, регулирует экспрессию провоспалительных цитокинов, таких как TNFα, ILβ, IL8, молекул адгезии (ICAM1, VCAM1, P-селектин) и простагландинов и оксида азота (NO). Наконец, у пациентов с аутоиммунными заболеваниями, такими как системная красная волчанка (СКВ), синдром Шегрена и ревматоидный артрит (РА), преобладают циркулирующие протеасомы, которые могут быть использованы в качестве клинических биомаркеров.

The proteasome and its subunits are of clinical significance for at least two reasons: (1) a compromised complex assembly or a dysfunctional proteasome can be associated with the underlying pathophysiology of specific diseases, and (2) they can be exploited as drug targets for therapeutic interventions. More recently, more effort has been made to consider the proteasome for the development of novel diagnostic markers and strategies. An improved and comprehensive understanding of the pathophysiology of the proteasome should lead to clinical applications in the future. The proteasomes form a pivotal component for the ubiquitin–proteasome system (UPS) and corresponding cellular Protein Quality Control (PQC). Protein ubiquitination and subsequent proteolysis and degradation by the proteasome are important mechanisms in the regulation of the cell cycle, cell growth and differentiation, gene transcription, signal transduction and apoptosis. Proteasome defects lead to reduced proteolytic activity and the accumulation of damaged or misfolded proteins, which may contribute to neurodegenerative disease, cardiovascular diseases, inflammatory responses and autoimmune diseases, and systemic DNA damage responses leading to malignancies. Research has implicated UPS defects in the pathogenesis of neurodegenerative and myodegenerative disorders, including Alzheimer's disease, Parkinson's disease and Pick's disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and motor neuron diseases, polyglutamine (PolyQ) diseases, muscular dystrophies and several rare forms of neurodegenerative diseases associated with dementia. As part of the ubiquitin–proteasome system (UPS), the proteasome maintains cardiac protein homeostasis and thus plays a significant role in cardiac ischemic injury, ventricular hypertrophy and heart failure. Additionally, evidence is accumulating that the UPS plays an essential role in malignant transformation. UPS proteolysis plays a major role in responses of cancer cells to stimulatory signals that are critical for the development of cancer. Accordingly, gene expression by degradation of transcription factors, such as p53, c jun, c Fos, NF κB, c Myc, HIF 1α, MATα2, STAT3, sterol regulated element binding proteins and androgen receptors are all controlled by the UPS and thus involved in the development of various malignancies. Moreover, the UPS regulates the degradation of tumor suppressor gene products such as adenomatous polyposis coli (APC) in colorectal cancer, retinoblastoma (Rb). and von Hippel–Lindau tumor suppressor (VHL), as well as a number of proto oncogenes (Raf, Myc, Myb, Rel, Src, Mos, ABL). The UPS is also involved in the regulation of inflammatory responses. This activity is usually attributed to the role of proteasomes in the activation of NF κB which further regulates the expression of pro inflammatory cytokines such as TNF α, IL β, IL 8, adhesion molecules (ICAM 1, VCAM 1, P selectin) and prostaglandins and nitric oxide (NO). Lastly, autoimmune disease patients with SLE, Sjögren syndrome and rheumatoid arthritis (RA) predominantly exhibit circulating proteasomes which can be applied as clinical biomarkers.