Микробная денитрификация: процесс и значение в экосистемах.

Введение

Денитрификация – это процесс, опосредованный микроорганизмами, при котором нитрат (NO3−) восстанавливается и в конечном итоге образует молекулярный азот (N2) через ряд промежуточных газообразных оксидов азота. Факультативные анаэробные бактерии осуществляют денитрификацию как тип дыхания, восстанавливая окисленные формы азота в ответ на окисление донора электронов, такого как органическое вещество. Предпочтительными акцепторами электронов азота, в порядке убывания термодинамической благоприятности, являются нитрат (NO3−), нитрит (NO2−), оксид азота (NO), закись азота (N2O), что в конечном итоге приводит к образованию динитрогена (N2) и завершению азотного цикла. Микроорганизмам, осуществляющим денитрификацию, требуется очень низкая концентрация кислорода – менее 10%, а также органический углерод в качестве источника энергии. Поскольку денитрификация может удалять NO3−, снижая его вымывание в грунтовые воды, ее можно стратегически использовать для очистки сточных вод или животноводческих отходов с высоким содержанием азота. Денитрификация может сопровождаться выбросом N2O, вещества, разрушающего озоновый слой, и парникового газа, оказывающего значительное влияние на глобальное потепление. Этот процесс в основном осуществляют гетеротрофные бактерии (например, Paracoccus denitrificans и различные псевдомонады), хотя также были идентифицированы автотрофные денитрификаторы (например, Thiobacillus denitrificans). Денитрификаторы представлены во всех основных филогенетических группах. Как правило, в полном восстановлении нитрата до N2 участвуют несколько видов бактерий, и в процессе восстановления было выявлено более одного ферментативного пути. Процесс денитрификации не только обеспечивает энергией организм, осуществляющий восстановление нитратов до динитрогена, но и некоторые анаэробные инфузории могут использовать денитрифицирующих эндосимбионтов для получения энергии, аналогично использованию митохондрий в организмах, дышащих кислородом. Прямое восстановление нитрата до аммония, процесс, известный как диссимиляторная редукция нитрата до аммония или DNRA, также возможно для организмов, обладающих геном nrf. Этот процесс менее распространен, чем денитрификация, в большинстве экосистем как способ восстановления нитратов. Другие гены, известные у микроорганизмов, осуществляющих денитрификацию, включают nir (нитритредуктаза) и nos (редуктаза закиси азота) и другие.

Microbially facilitated process

Denitrification is a microbially facilitated process where nitrate (NO3−) is reduced and ultimately produces molecular nitrogen (N2) through a series of intermediate gaseous nitrogen oxide products. Facultative anaerobic bacteria perform denitrification as a type of respiration that reduces oxidized forms of nitrogen in response to the oxidation of an electron donor such as organic matter. The preferred nitrogen electron acceptors in order of most to least thermodynamically favorable include nitrate (NO3−), nitrite (NO2−), nitric oxide (NO), nitrous oxide (N2O) finally resulting in the production of dinitrogen (N2) completing the nitrogen cycle. Denitrifying microbes require a very low oxygen concentration of less than 10%, as well as organic C for energy. Since denitrification can remove NO3−, reducing its leaching to groundwater, it can be strategically used to treat sewage or animal residues of high nitrogen content. Denitrification can leak N2O, which is an ozone depleting substance and a greenhouse gas that can have a considerable influence on global warming. The process is performed primarily by heterotrophic bacteria (such as Paracoccus denitrificans and various pseudomonads), although autotrophic denitrifiers have also been identified (e. g., Thiobacillus denitrificans). Denitrifiers are represented in all main phylogenetic groups. Generally several species of bacteria are involved in the complete reduction of nitrate to N2, and more than one enzymatic pathway has been identified in the reduction process. The denitrification process does not only provide energy to the organism performing nitrate reduction to dinitrogen gas, but also some anaerobic ciliates can use denitrifying endosymbionts to gain energy similar to the use of mitochondria in oxygen respiring organisms. Direct reduction from nitrate to ammonium, a process known as dissimilatory nitrate reduction to ammonium or DNRA, is also possible for organisms that have the nrf gene. This is less common than denitrification in most ecosystems as a means of nitrate reduction. Other genes known in microorganisms which denitrify include nir (nitrite reductase) and nos (nitrous oxide reductase) among others;

Условия денитрификации

В природе денитрификация может происходить как в наземных, так и в морских экосистемах. Как правило, денитрификация происходит в аноксических средах, где концентрация растворенного и свободно доступного кислорода истощается. В этих областях нитрат (NO3−) или нитрит (−) могут использоваться в качестве замещающего терминального акцептора электронов вместо кислорода (O2), который является более энергетически выгодным акцептором электронов. Терминальный акцептор электронов – это соединение, которое восстанавливается в реакции, принимая электроны. Примеры аноксических сред включают почвы, грунтовые воды, водно-болотные угодья, нефтяные резервуары, плохо вентилируемые участки океана и осадочные отложения морского дна. Кроме того, денитрификация может происходить и в оксических средах. Высокая активность денитрификаторов наблюдается в межприливных зонах, где приливные циклы вызывают колебания концентрации кислорода в песчаных прибрежных отложениях. Например, бактериальный вид *Paracoccus denitrificans* осуществляет денитрификацию одновременно в оксических и аноксических условиях. При воздействии кислорода бактерии способны использовать оксид азота редуктазу, фермент, который катализирует последнюю стадию денитрификации. Аэробные денитрификаторы – это преимущественно грамотрицательные бактерии из типа Proteobacteria. Ферменты NapAB, NirS, NirK и NosZ локализованы в периплазме – широком пространстве, ограниченном цитоплазматической и внешней мембранами у грамотрицательных бактерий. Разнообразные факторы окружающей среды могут влиять на скорость денитрификации в масштабах всей экосистемы. Например, температура и pH оказывают влияние на скорость денитрификации. У бактериального вида *Pseudomonas mandelii* экспрессия генов, участвующих в денитрификации, снижалась при температуре ниже 30 °C и pH ниже 5, в то время как активность существенно не изменялась при pH 6–8. Органический углерод как донор электронов часто является лимитирующим питательным веществом для денитрификации, что наблюдается в бентосных отложениях и водно-болотных угодьях. Нитраты и кислород также могут быть потенциальными лимитирующими факторами для денитрификации, хотя последний проявляет ограничивающее действие только во влажных почвах. Кислород, вероятно, влияет на денитрификацию несколькими способами: поскольку большинство денитрификаторов являются факультативными, кислород может подавлять скорость реакции, но также может стимулировать денитрификацию, способствуя нитрификации и образованию нитратов. Во влажных землях и пустынях влажность является экологическим ограничением скорости денитрификации. Кроме того, факторы окружающей среды могут влиять на полноту протекания денитрификации, характеризующейся полным восстановлением NO3 до N2, а не выделением N2O в качестве конечного продукта. pH и текстура почвы – факторы, которые могут модулировать денитрификацию, при этом более высокие значения pH способствуют более полному завершению реакции. Состав питательных веществ, особенно соотношение углерода к азоту, оказывает значительное влияние на полную денитрификацию, при этом соотношение C:N 2:1 может способствовать полному восстановлению нитратов независимо от температуры или источника углерода. Медь, как кофактор нитритредуктазы и оксида азота редуктазы, также способствовала полной денитрификации при добавлении в качестве добавки. Помимо питательных веществ и рельефа, состав микробного сообщества также может влиять на соотношение полной денитрификации, при этом прокариотические типы Actinomycetota и Thermoproteota ответственны за большее выделение N2, чем N2O, по сравнению с другими прокариотами. Денитрификация может приводить к явлению, называемому изотопным фракционированием в почвенной среде. Два стабильных изотопа азота, 14N и 15N, обнаруживаются в профилях отложений. Более легкий изотоп азота, 14N, предпочтителен в процессе денитрификации, оставляя более тяжелый изотоп азота, 15N, в остаточном веществе. Эта селективность приводит к обогащению биомассы 14N по сравнению с 15N. Более того, относительное содержание 14N можно анализировать для дифференциации денитрификации от других процессов в природе.

In nature, denitrification can take place in both terrestrial and marine ecosystems. Typically, denitrification occurs in anoxic environments, where the concentration of dissolved and freely available oxygen is depleted. In these areas, nitrate (NO3−) or nitrite (−) can be used as a substitute terminal electron acceptor instead of oxygen (O2), a more energetically favourable electron acceptor. Terminal electron acceptor is a compound that gets reduced in the reaction by receiving electrons. Examples of anoxic environments can include soils, groundwater, wetlands, oil reservoirs, poorly ventilated corners of the ocean and seafloor sediments. Furthermore, denitrification can occur in oxic environments as well. High activity of denitrifiers can be observed in the intertidal zones, where the tidal cycles cause fluctuations of oxygen concentration in sandy coastal sediments. For example, the bacterial species Paracoccus denitrificans engages in denitrification under both oxic and anoxic conditions simultaneously. Upon oxygen exposure, the bacteria is able to utilize nitrous oxide reductase, an enzyme that catalyzes the last step of denitrification. Aerobic denitrifiers are mainly Gram negative bacteria in the phylum Proteobacteria. Enzymes NapAB, NirS, NirK and NosZ are located in the periplasm, a wide space bordered by the cytoplasmic and the outer membrane in Gram negative bacteria. A variety of environmental factors can influence the rate of denitrification on an ecosystem wide scale. For example, temperature and pH have been observed to impact denitrification rates. In the bacterial species, Pseudomonas mandelii, expression of denitrifying genes was reduced at temperatures below 30 °C and a pH below 5, while activity was largely unaffected between a pH of 6 8. Organic carbon as an electron donor is a common limiting nutrient for denitrification as observed in benthic sediments and wetlands. Nitrate and oxygen can also be potential limiting factors for denitrification, although the latter only has an observed limiting effect in wet soils. Oxygen likely affects denitrification in multiple ways—because most denitrifiers are facultative, oxygen can inhibit rates, but it can also stimulate denitrification by facilitating nitrification and the production of nitrate. In wetlands as well as deserts, moisture is an environmental limitation to rates of denitrification. Additionally, environmental factors can also influence whether denitrification proceeds to completion, characterized by the complete reduction of NO3 to N2 rather than releasing N2O as an end product. Soil pH and texture are both factors that can moderate denitrification, with higher pH levels driving the reaction more to completion. Nutrient composition, particularly the ratio of carbon to nitrogen, is a strong contributor to complete denitrification, with a 2:1 ratio of C:N being able to facilitate full nitrate reduction regardless of temperature or carbon source. Copper, as a co factor for nitrite reductase and nitrous oxide reductase, also promoted complete denitrification when added as a supplement. Besides nutrients and terrain, microbial community composition can also affect the ratio of complete denitrification, with prokaryotic phyla Actinomycetota and Thermoproteota being responsible for greater release of N2 than N2O compared to other prokaryotes. Denitrification can lead to a condition called isotopic fractionation in the soil environment. The two stable isotopes of nitrogen, 14N and 15N are both found in the sediment profiles. The lighter isotope of nitrogen, 14N, is preferred during denitrification, leaving the heavier nitrogen isotope, 15N, in the residual matter. This selectivity leads to the enrichment of 14N in the biomass compared to 15N. Moreover, the relative abundance of 14N can be analyzed to distinguish denitrification apart from other processes in nature.