Введение
Преобразование молекулярного азота в биологически доступные соединения азота
Фиксация азота – это химический процесс, в ходе которого молекулярный азот, обладающий прочной тройной ковалентной связью, превращается в аммиак или родственные азотистые соединения, как правило, в почвенных или водных системах, но также и в промышленности. Азот в воздухе представляет собой молекулярный динитроген – относительно нереактивную молекулу, метаболически бесполезную для всех, кроме немногих микроорганизмов. Биологическая фиксация азота, или диазотрофия, – это важный процесс, опосредованный микроорганизмами, который преобразует газ динитроген (N2) в аммиак (NH3) с использованием белкового комплекса нитрогеназы (Nif). Фиксация азота необходима для жизни, поскольку фиксированные неорганические соединения азота требуются для биосинтеза всех органических соединений, содержащих азот, таких как аминокислоты и белки, нуклеозидтрифосфаты и нуклеиновые кислоты. Являясь частью круговорота азота, она имеет важное значение для сельского хозяйства и производства удобрений. Кроме того, она косвенно связана с производством всех азотсодержащих химических соединений, включая некоторые взрывчатые вещества, фармацевтические препараты и красители. Фиксация азота естественным образом осуществляется в почве микроорганизмами, называемыми диазотрофами, к которым относятся бактерии, такие как Azotobacter и Rhizobia, и археи. Некоторые азотфиксирующие бактерии находятся в симбиотических отношениях с группами растений, особенно бобовыми. Более свободные несимбиотические отношения между диазотрофами и растениями часто называют ассоциативными, как, например, фиксация азота на корнях риса. Фиксация азота происходит также между некоторыми термитами и грибами. В природе она происходит в воздухе в результате образования NOx под воздействием молний. Все биологические реакции, связанные с процессом фиксации азота, катализируются ферментами, называемыми нитрогеназами. Эти ферменты содержат железо, часто в сочетании со вторым металлом, обычно молибденом, но иногда и ванадием.
История
Биологическая фиксация азота была обнаружена Жаном Батистом Бусинго в 1838 году. Позднее, в 1880 году, немецкие агрономы Герман Хеллригель и Герман Вильфарт обнаружили механизм этого процесса, а голландский микробиолог Мартинус Бейеринк полностью его описал. "Длительные исследования взаимосвязи растений и усвоения азота, начатые де Соссюром, Вилле, Лоуэсом, Гилбертом и другими, завершились открытием симбиотической фиксации Хеллригелем и Вильфартом в 1887 году". "Эксперименты Бусинго в 1855 году и Пью, Гилберта и Лоуэса в 1887 году показали, что азот не поступает в растения напрямую. Открытие роли азотфиксирующих бактерий Германом Хеллригелем и Германом Вильфартом в 1886–1888 годах положило начало новой эре в почвоведении". В 1901 году Бейеринк показал, что Azotobacter chroococcum способен фиксировать атмосферный азот. Это был первый вид рода Azotobacter, получивший название от него. Это также первый известный диазотроф – вид, использующий двухатомный азот на одном из этапов полного круговорота азота.
Биологические
Биологическая фиксация азота (BNF) происходит, когда атмосферный азот превращается в аммиак ферментом нитрогеназой. Превращение в аммиак происходит в металлическом кластере, называемом FeMoco – сокращение от кофактора железо-молибдена. Механизм протекает через серию стадий протонирования и восстановления, в ходе которых активный центр FeMoco гидрирует субстрат. У свободноживущих диазотрофов аммиак, образующийся в результате действия нитрогеназы, ассимилируется в глутамат посредством пути глутаминсинтетазы/глутаматсинтетазы. Микробные гены *nif*, необходимые для фиксации азота, широко распространены в различных средах. Например, было показано, что разлагающаяся древесина, обычно с низким содержанием азота, является средой обитания для диазотрофного сообщества. Бактерии обогащают древесный субстрат азотом посредством фиксации, тем самым обеспечивая разложение мертвой древесины грибами. Нитрогеназы быстро разрушаются кислородом. По этой причине многие бактерии прекращают производство фермента в присутствии кислорода. Многие азотфиксирующие организмы существуют только в анаэробных условиях, осуществляя дыхание для снижения уровня кислорода или связывая кислород с белком, таким как легемоглобин, поскольку их тройная ковалентная связь очень прочна. Большинство организмов поглощают фиксированный азот из различных источников. На каждые 100 атомов углерода ассимилируется примерно от 2 до 20 атомов азота. Атомное соотношение углерода (C) : азота (N) : фосфора (P), наблюдаемое в среднем в планктонной биомассе, впервые было описано Альфредом Редфилдом, который определил стехиометрическое соотношение между атомами C:N:P, известное как соотношение Редфильда, равное 106:16:1. У цианобактерий эта ферментная система находится в специализированной клетке, называемой гетероцистом. Производство комплекса нитрогеназы генетически регулируется, а активность белкового комплекса зависит от концентрации окружающего кислорода, внутри- и внеклеточных концентраций аммиака и окисленных форм азота (нитратов и нитритов). Кроме того, считается, что совместные концентрации аммония и нитрата ингибируют NFix, особенно когда внутриклеточные концентрации 2-оксоглутарата (2-OG) превышают критический порог. Специализированная гетероцистовая клетка необходима для функционирования нитрогеназы из-за ее чувствительности к окружающему кислороду. Нитрогеназа состоит из двух белков: каталитического железозависимого белка, обычно называемого MoFe-белком, и железосодержащего редуктазного белка (Fe-белка). Существует три различных железозависимых белка: молибденозависимый, ванадиезависимый и только железосодержащий, причем все три варианта белка нитрогеназы содержат компонент Fe-белка. Молибденозависимая нитрогеназа является наиболее распространенной формой. Нитрогеназа высоко консервативна. Экспрессия генов посредством секвенирования ДНК позволяет определить, какой белковый комплекс присутствует в микроорганизме и потенциально экспрессируется. Чаще всего ген *nifH* используется для идентификации присутствия молибденозависимой нитрогеназы, за которым следуют близкородственные нитрогеназные редуктазы (компонент II) *vnfH* и *anfH*, представляющие ванадиезависимую и только железосодержащую нитрогеназу соответственно. При изучении экологии и эволюции азотфиксирующих бактерий ген *nifH* является наиболее широко используемым биомаркером. Гены *nifH* имеют два схожих гена *anfH* и *vnfH*, которые также кодируют компонент нитрогеназоредуктазы комплекса нитрогеназы.
Эволюция азотного фермента
Происхождение нитрогеназы представляет интерес для палеобиологов и является областью активных исследований. Предполагается, что нитрогеназа эволюционировала между 1,5 и 2,2 миллиардами лет назад (млрд лет), хотя некоторые изотопные данные указывают на возможное появление нитрогеназы уже около 3,2 млрд лет назад. Нитрогеназа, по-видимому, произошла от белков, подобных матуразам, однако функция предшествующего белка в настоящее время не установлена. Нитрогеназа существует в трех различных формах (Nif, Anf и Vnf), соответствующих металлу в активном центре белка (молибдену, железу и ванадию соответственно). Считается, что изменения в концентрации металлов в океане на протяжении геологической истории Земли влияли на относительное распространение различных форм нитрогеназы. В настоящее время нет однозначного мнения о том, какая форма нитрогеназы возникла первой.
Микроорганизмы
Диазотрофы широко распространены в домене бактерий, включая цианобактерии (например, весьма значимые Trichodesmium и Cyanothece), зеленые серные бактерии, фиолетовые серные бактерии, Azotobacteraceae, ризобии и Frankia. Несколько облигатно анаэробных бактерий фиксируют азот, включая многие (но не все) Clostridium spp. Некоторые археи, такие как Methanosarcina acetivorans, также фиксируют азот, и несколько других метаногенных таксонов вносят значительный вклад в фиксацию азота в почвах с дефицитом кислорода. Цианобактерии, обычно известные как голубо-зеленые водоросли, обитают почти во всех освещенных средах на Земле и играют ключевую роль в углеродном и азотном циклах биосферы. В целом, цианобактерии могут использовать различные неорганические и органические источники связанного азота, такие как нитраты, нитриты, аммоний, мочевина или некоторые аминокислоты. Несколько штаммов цианобактерий также способны к диазотрофному росту, способность, которая могла присутствовать у их последнего общего предка в архейском эоне. Фиксация азота происходит не только в почве, но и в водных системах, включая пресноводные и морские. Фактически, количество азота, фиксируемого в океане, по крайней мере, равно количеству азота, фиксируемого на суше. Считается, что колониальная морская цианобактерия Trichodesmium фиксирует азот в таком масштабе, что на нее приходится почти половина фиксации азота в морских системах во всем мире. Морские поверхностные лишайники и нефотосинтезирующие бактерии, принадлежащие к протеобактериям и планктомицетам, фиксируют значительное количество атмосферного азота. К видам цианобактерий, фиксирующих азот в пресных водах, относятся: Aphanizomenon и Dolichospermum (ранее Anabaena). У таких видов есть специализированные клетки, называемые гетероцитами, в которых происходит фиксация азота посредством фермента нитрогеназы.
Водоросли
Один тип органелл способен превращать азот из газообразного состояния в биологически усвояемую форму. Этот нитропласт был обнаружен у водорослей.
Семейство бобовых
Растения, способствующие фиксации азота, включают в себя растения семейства бобовых (Fabaceae) – такие таксоны, как кудзу, клевер, соя, люцерна, люпин, арахис и ройбуш. Когда растение отмирает, фиксированный азот высвобождается, становясь доступным для других растений; это способствует удобрению почвы. Подавляющее большинство бобовых обладает этой способностью, однако некоторые роды (например, Styphnolobium) – нет. Во многих традиционных сельскохозяйственных практиках поля чередуют различными культурами, среди которых обычно присутствует культура, состоящая преимущественно или полностью из клевера. Эффективность фиксации азота в почве зависит от множества факторов, включая вид бобового растения, а также условия воздуха и почвы. Например, фиксация азота красным клевером может колебаться от .
Исторические
Метод фиксации азота был впервые описан Генри Кавендишем в 1784 году с использованием электрических дуг, вызывающих реакцию азота и кислорода в воздухе. Этот метод был реализован в процессе Биркеланд — Эйде в 1903 году. Фиксация азота молнией — очень похожий природный процесс. Возможность взаимодействия атмосферного азота с определенными химическими веществами была впервые отмечена Десфоссом в 1828 году. Он обнаружил, что смеси оксидов щелочных металлов и углерода реагируют с азотом при высоких температурах. С использованием карбоната бария в качестве исходного материала, первый коммерческий процесс стал доступен в 1860-х годах и был разработан Маргариттом и Сурдевалем. Полученный цианид бария реагирует с водяным паром, образуя аммиак. В 1898 году Фрэнк и Каро разработали так называемый процесс Фрэнка — Каро для фиксации азота в форме цианамида кальция. Этот процесс был вытеснен процессом Габера, который был открыт в 1909 году.
Процесс Хабера
Доминирующим промышленным методом производства аммиака является процесс Габера, также известный как процесс Габера-Боша. Производство удобрений в настоящее время является крупнейшим источником азота, фиксированного человеком, в наземных экосистемах. Аммиак является необходимым предшественником для производства удобрений, взрывчатых веществ и других продуктов. Процесс Габера требует высоких давлений (около 200 атм) и высоких температур (не менее 400 °C), что является стандартными условиями для промышленного катализа. В этом процессе в качестве источника водорода используется природный газ, а в качестве источника азота – воздух. Благодаря производству аммиака во всем мире значительно увеличилось использование азотных удобрений, что, как считается, позволило увеличить численность населения с примерно 2 миллиардов в начале 20-го века до нынешних 8 миллиардов человек.
Гомогенный катализатор
Много исследований было проведено в области поиска катализаторов для фиксации азота, часто с целью снижения энергозатрат. Однако на сегодняшний день этим исследованиям не удалось достичь эффективности и простоты процесса Габера. Многие соединения реагируют с атмосферным азотом, образуя комплексы с динитрогеном. Первым сообщенным комплексом с динитрогеном был комплекс с зарядом 2+. Некоторые растворимые комплексы катализируют фиксацию азота.
Молния
Азот может быть зафиксирован молнией, преобразуя азотный газ и кислородный газ в атмосфере в (окислы азота). Молекула очень стабильна и нереакционноспособна из-за тройной связи между атомами азота. Молния производит достаточно энергии и тепла, чтобы разорвать эту связь, которая, в свою очередь, реагирует с водой, образуя (азотистую кислоту) или (азотную кислоту). Когда эти кислоты просачиваются в почву, они образуют NO3 (нитрат), который полезен для растений.