Метод фиксации напряжения: от гигантского аксона кальмара до модели Ходжкина-Хаксли.
Voltage clamp
Вольтаж-зажим: метод электрофизиологии для измерения ионных токов в возбудимых клетках (нейронах). Поддержание постоянного напряжения для анализа реакций клетки.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
Напряженный зажим — экспериментальный метод, используемый электрофизиологами для измерения ионных токов через мембраны возбудимых клеток, таких как нейроны, поддерживая при этом напряжение на мембране на заданном уровне. Базовый напряженный зажим последовательно измеряет мембранный потенциал, а затем изменяет мембранный потенциал (напряжение) до желаемого значения, добавляя необходимый ток. Это "фиксирует" мембрану клетки на желаемом постоянном напряжении, позволяя напряженному зажиму регистрировать протекающие токи. Поскольку токи, подаваемые в клетку, должны быть равны (и противоположны по знаку) току, проходящему через мембрану клетки при заданном напряжении, зарегистрированные токи показывают, как клетка реагирует на изменения мембранного потенциала.
The voltage clamp is an experimental method used by electrophysiologists to measure the ion currents through the membranes of excitable cells, such as neurons, while holding the membrane voltage at a set level. A basic voltage clamp will iteratively measure the membrane potential, and then change the membrane potential (voltage) to a desired value by adding the necessary current. This "clamps" the cell membrane at a desired constant voltage, allowing the voltage clamp to record what currents are delivered. Because the currents applied to the cell must be equal to (and opposite in charge to) the current going across the cell membrane at the set voltage, the recorded currents indicate how the cell reacts to changes in membrane potential.
История
Концепция напряжения зажима приписывается Кеннету Коулу и Джорджу Мармонту весной 1947 года. Они ввели внутренний электрод в гигантский аксон кальмара и начали подавать ток. Коул обнаружил, что можно использовать два электрода и схему обратной связи для поддержания потенциала мембраны клетки на уровне, заданном экспериментатором. Коул разработал технику напряжения зажима до эры микроэлектродов, поэтому его два электрода состояли из тонких проводов, скрученных вокруг изолирующего стержня. Поскольку этот тип электрода можно было ввести только в самые крупные клетки, ранние электрофизиологические эксперименты проводились почти исключительно на аксонах кальмаров. Кальмары выбрасывают струи воды, когда им нужно быстро двигаться, например, при спасении от хищника. Чтобы сделать этот побег максимально быстрым, у них есть аксон, который может достигать 1 мм в диаметре (сигналы распространяются быстрее по большим аксонам). Гигантский аксон кальмара был первым препаратом, который можно было использовать для зажима напряжения трансмембранного тока, и он послужил основой для новаторских экспериментов Ходжкина и Хаксли по свойствам потенциала действия. Используя эксперименты с напряжением зажима, Ходжкин и Эндрю Хаксли опубликовали 5 статей летом 1952 года, описывающих, как ионные токи генерируют потенциал действия. В заключительной статье была предложена модель Ходжкина — Хаксли, математически описывающая потенциал действия. Использование напряжения зажима в их экспериментах для детального изучения и моделирования потенциала действия заложило основу для электрофизиологии, за что они разделили Нобелевскую премию по физиологии или медицине в 1963 году. Исследователи чаще всего используют этот метод для изучения мембранных структур, экспрессированных в ооцитах Xenopus. Большой размер этих ооцитов облегчает их обработку и манипулирование. Метод TEVC использует две пипетки с низким сопротивлением, одна из которых измеряет напряжение, а другая вводит ток. Микроэлектроды заполняются проводящим раствором и вводятся в клетку для искусственного контроля потенциала мембраны. Мембрана действует как диэлектрик и как резистор, а жидкости по обе стороны мембраны функционируют как конденсаторы. Система с двумя электродами также предпочтительна из-за быстрого времени установления зажима и низкого уровня шума. Однако применение TEVC ограничено размером клеток. Он эффективен для ооцитов большого диаметра, но его сложнее использовать с мелкими клетками. Кроме того, метод TEVC ограничен тем, что проводник тока должен находиться внутри пипетки. Невозможно манипулировать внутриклеточной жидкостью во время зажима, что возможно при использовании техники патч-зажима. Еще одним недостатком являются проблемы с "пространственным зажимом". Напряжение зажима Коула использовало длинный провод, который равномерно зажимал аксон кальмара по всей его длине. Микроэлектроды TEVC могут обеспечивать только точечный источник тока, который может неравномерно воздействовать на все части клетки неправильной формы.
The concept of the voltage clamp is attributed to Kenneth Cole and George Marmont in the spring of 1947. They inserted an internal electrode into the giant axon of a squid and began to apply a current. Cole discovered that it was possible to use two electrodes and a feedback circuit to keep the cell's membrane potential at a level set by the experimenter. Cole developed the voltage clamp technique before the era of microelectrodes, so his two electrodes consisted of fine wires twisted around an insulating rod. Because this type of electrode could be inserted into only the largest cells, early electrophysiological experiments were conducted almost exclusively on squid axons. Squids squirt jets of water when they need to move quickly, as when escaping a predator. To make this escape as fast as possible, they have an axon that can reach 1 mm in diameter (signals propagate more quickly down large axons). The squid giant axon was the first preparation that could be used to voltage clamp a transmembrane current, and it was the basis of Hodgkin and Huxley's pioneering experiments on the properties of the action potential. Using experiments with the voltage clamp, Hodgkin and Andrew Huxley published 5 papers in the summer of 1952 describing how ionic currents give rise to the action potential. The final paper proposed the Hodgkin–Huxley model which mathematically describes the action potential. The use of voltage clamps in their experiments to study and model the action potential in detail has laid the foundation for electrophysiology; for which they shared the 1963 Nobel Prize in Physiology or Medicine. Researchers use this method most commonly to investigate membrane structures expressed in Xenopus oocytes. The large size of these oocytes allows for easy handling and manipulability. The TEVC method utilizes two low resistance pipettes, one sensing voltage and the other injecting current. The microelectrodes are filled with conductive solution and inserted into the cell to artificially control membrane potential. The membrane acts as a dielectric as well as a resistor, while the fluids on either side of the membrane function as capacitors. The two electrode system is also desirable for its fast clamp settling time and low noise. However, TEVC is limited in use with regard to cell size. It is effective in larger diameter oocytes, but more difficult to use with small cells. Additionally, TEVC method is limited in that the transmitter of current must be contained in the pipette. It is not possible to manipulate the intracellular fluid while clamping, which is possible using patch clamp techniques. Another disadvantage involves "space clamp" issues. Cole's voltage clamp used a long wire that clamped the squid axon uniformly along its entire length. TEVC microelectrodes can provide only a spatial point source of current that may not uniformly affect all parts of an irregularly shaped cell.