Введение

Класс ферментов

Фермент глюкозооксидаза (GOx или GOD), также известный как нотатин (EC номер 1.1.3.4), является оксидоредуктазой, катализирующей окисление глюкозы до перекиси водорода и D-глюконо-δ-лактона. Этот фермент продуцируется определенными видами грибов и насекомых и проявляет антибактериальную активность в присутствии кислорода и глюкозы. Глюкозооксидаза широко используется для определения свободной глюкозы в биологических жидкостях (медицинское тестирование), в растительном сырье и в пищевой промышленности. Она также имеет множество применений в биотехнологиях, как правило, в ферментных анализах для биохимии, включая биосенсоры в нанотехнологиях. Впервые она была выделена Детлевом Мюллером в 1928 году из Aspergillus niger.

Функция

Несколько видов грибов и насекомых синтезируют глюкозооксидазу, которая производит перекись водорода, убивающую бактерии. Было установлено, что нотатин идентичен пенициллину B и глюкозооксидазе – ферментам, выделенным из плесеней, отличных от P. notatum; в настоящее время он общеизвестен как глюкозооксидаза. Испытания in vivo показали, что нотатин неэффективен для защиты грызунов от Streptococcus haemolyticus, Staphylococcus aureus или сальмонелл и при определенных дозах вызывал серьезные повреждения тканей.

Структура

GOx — это димерный белок, чья трехмерная структура была установлена. Активный центр, где связывается глюкоза, находится в глубоком углублении. Фермент, как и многие белки, действующие вне клеток, покрыт углеводными цепями. GOx — это глюкозоокислительный фермент с молекулярной массой 160 кДа. Это димерный гликопротеин, состоящий из двух субъединиц, каждая из которых весит 80 кДа. Флавинадениндинуклеотид (FAD) в активном центре находится примерно на 1,5 нм внутри белковой оболочки и выступает в качестве первичного акцептора электронов.

Механизм

При pH 7 глюкоза в растворе существует преимущественно в циклической гемиацетальной форме, в виде 63,6% β-D-глюкопиранозы и 36,4% α-D-глюкопиранозы, при этом содержание линейной и фуранозной форм пренебрежимо мало. Глюкозооксидаза специфически связывается с β-D-глюкопиранозой и не действует на α-D-глюкозу. Она окисляет всю глюкозу в растворе, поскольку равновесие между α- и β-аномерами смещается в сторону β-формы по мере ее потребления в реакции. Затем FADH− окисляется конечным акцептором электронов, молекулярным кислородом (O2), что возможно благодаря его более высокому окислительно-восстановительному потенциалу. В результате O2 восстанавливается до перекиси водорода (H2O2).

Мониторинг глюкозы

Глюкозооксидаза широко используется в сочетании с реакцией пероксидазы, колориметрически визуализирующей образовавшуюся H2O2, для определения концентрации свободной глюкозы в сыворотке или плазме крови в диагностических целях. Для этого используются спектрометрические анализы, выполняемые вручную или автоматизированными методами, а также экспресс-тесты, проводимые непосредственно в месте отбора образца. Подобные анализы позволяют контролировать уровень глюкозы в процессах ферментации, биореакторах, а также в растительном сырье и пищевых продуктах. В анализе с использованием глюкозооксидазы глюкоза сначала окисляется под действием глюкозооксидазы, образуя глюконат и перекись водорода. Перекись водорода, в свою очередь, окислительно связывается с хромогеном, образуя окрашенное соединение, которое можно измерить спектроскопически. Например, взаимодействие перекиси водорода с 4-аминоантипиреном (4 ААП) и фенолом в присутствии пероксидазы приводит к образованию красного квиноэиминового красителя, измеряемого при длине волны 505 нм. Абсорбция при 505 нм пропорциональна концентрации глюкозы в образце. Энзимные глюкозные биосенсоры используют электрод вместо кислорода для приема электронов, необходимых для окисления глюкозы и создания электронного тока, пропорционального концентрации глюкозы. Эта технология лежит в основе одноразовых тест-полосок для глюкозы, используемых людьми с диабетом для контроля уровня глюкозы в сыворотке крови.

Консервирование пищевых продуктов

В производстве GOx используется в качестве добавки благодаря своим окислительным свойствам: он способствует формированию более крепкого теста при выпечке, заменяя окислители, такие как бромат. Он также применяется в качестве пищевого консерванта для удаления кислорода и глюкозы из продуктов при упаковке, например, сухого яичного порошка, чтобы предотвратить нежелательное потемнение и ухудшение вкуса.

Лечение ран

В средствах для ухода за ранами, таких как "Flaminal Hydro", используется альгинатный гидрогель, содержащий глюкозооксидазу и другие компоненты в качестве окисляющего агента.

Клинические испытания

Назальный спрей в баллоне с дозирующим клапаном, содержащий глюкозооксидазу и глюкозу, прошел клинические испытания в 2016 году для профилактики и лечения обычной простуды.