Введение
Виды бактериофагов
Вирус Escherichia T4 — это вид бактериофагов, заражающих бактерии Escherichia coli. Это ДНК-вирус с двойной цепью из подсемейства Tevenvirinae семейства Myoviridae. T4 способен осуществлять только литический цикл развития и не способен к лизогенному циклу. Ранее этот вид назывался T-четным бактериофагом, название, которое также охватывало, среди прочих штаммов (или изолятов), фаг энтеробактерий T2, фаг энтеробактерий T4 и фаг энтеробактерий T6.
Использование в исследованиях
Начиная с 1940-х годов и по сей день, Т-фаги считаются наиболее изученными модельными организмами. Обычно модельные организмы должны быть простыми, содержать как можно меньше генов – в идеале, не более пяти. Однако Т-фаги на самом деле относятся к числу самых крупных и сложных вирусов, геном которых состоит примерно из 300 генов. В соответствии со своей сложностью, у Т-фагов было обнаружено необычное основание гидроксиметилцитозин (HMC) вместо обычного нуклеотидного основания цитозина.
Геном и структура
Двухцепочечный геном ДНК вируса T4 имеет длину около 169 кбп и кодирует 289 белков. Геном T4 имеет концевую избыточность. При репликации ДНК формируются длинные конкатемеры, содержащие несколько копий генома, возможно, посредством механизма репликации с катящимся кругом. При упаковке конкатемер разрезается в неспецифических позициях на фрагменты одинаковой длины, в результате чего образуются несколько геномов, представляющих собой циклические перестановки исходного генома. Геном T4 содержит последовательности, подобные эукариотическим интронам.
Перевод
В ранних генах вируса T4 преобладает последовательность Shine-Dalgarno GAGG, в то время как последовательность GGAG является мишенью для эндонуклеазы T4 RegB, инициирующей деградацию ранней мРНК.
Структура вирусных частиц
T4 – относительно большой вирус, шириной около 90 нм и длиной 200 нм (большинство вирусов имеют длину от 25 до 200 нм). Геном ДНК содержится в икосаэдрической головке, также известной как капсид. Хвост T4 полый, что позволяет ему вводить свою нуклеиновую кислоту в инфицируемую клетку после прикрепления. Фаги семейства Myoviridae, такие как T4, обладают сложными сократительными структурами хвоста, включающими большое количество белков, участвующих в сборке и функционировании хвоста. Хвостовые волокна также важны для распознавания рецепторов на поверхности клеток-хозяев, определяя, входит ли бактерия в диапазон хозяев вируса. Структура 6-мегадальтоновой базовой пластины T4, состоящей из 127 полипептидных цепей 13 различных белков (генные продукты 5, 5.4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 25, 27, 48 и 53), недавно была описана с атомарной детализацией. Также была создана атомарная модель проксимального участка хвостовой трубки, образованной gp54 и основным белком трубки gp19. Белок gp29 присутствует в комплексах хвостовой трубки основной пластины, но его моделирование не удалось. В процессе сборки вириона бактериофага (фага) T4 морфогенетические белки, кодируемые генами фага, взаимодействуют друг с другом в характерной последовательности. Поддержание соответствующего баланса количества каждого из этих белков, производимых во время вирусной инфекции, представляется критически важным для нормального морфогенеза фага T4. Белки, кодируемые фагом T4 и определяющие структуру вириона, включают основные структурные компоненты, второстепенные структурные компоненты и неструктурные белки, которые катализируют специфические этапы в последовательности морфогенеза. Морфогенез фага T4 разделен на три независимых пути: формирование головки, формирование хвоста и формирование длинных хвостовых волокон, как подробно описано Япом и Россманом.
Процесс заражения
Вирус T4 инициирует инфекцию Escherichia coli, связываясь с OmpC порниновыми белками и липополисахаридами (LPS) на поверхности клеток E. coli с помощью своих длинных хвостовых волокон (LTF). Сигнал распознавания передается через LTF на базовую пластину. Это раскручивает короткие хвостовые волокна (STF), которые необратимо связываются с поверхностью клеток E. coli. Базовая пластина изменяет конформацию, а хвостовая оболочка сокращается, в результате чего GP5 на конце хвостовой трубки проникает через внешнюю мембрану клетки. Лизоцимный домен GP5 активируется и разрушает периплазматический пептидогликановый слой. Оставшаяся часть мембраны разрушается, после чего ДНК из головки вируса может проходить через хвостовую трубку и попадать в клетку E. coli. В 1952 году Херши и Чейз предоставили ключевые доказательства того, что ДНК фага, в отличие от белка, проникает в клетку бактерии-хозяина при заражении и, таким образом, является генетическим материалом фага. Это открытие позволило предположить, что ДНК в целом является генетическим материалом различных организмов.
Адсорбция и проникновение
Как и все другие вирусы, T-четные фаги не прикрепляются к поверхности хозяина случайным образом; вместо этого они "ищут" и связываются с рецепторами – специфическими белковыми структурами, находящимися на поверхности хозяина. Эти рецепторы варьируются в зависимости от фага: теихоевая кислота, белки клеточной стенки и липополисахариды, флагеллы и пили могут служить рецепторами для связывания фага. Для того чтобы T-четный фаг инфицировал хозяина и начал свой жизненный цикл, он должен вступить в первый этап инфекции – адсорбцию фага к бактериальной клетке. Адсорбция является величиной, характерной для пары фаг-хозяин, и адсорбция фага на поверхности клетки-хозяина описывается как двухстадийный процесс: обратимый и необратимый. В этот процесс вовлечена структура хвоста фага, который начинает свое действие, когда хвостовые волокна фага помогают связать фаг с соответствующим рецептором хозяина. Этот процесс является обратимым. Один или несколько компонентов базовой пластины опосредуют необратимый процесс связывания фага с бактерией. Проникновение также является величиной, характерной для инфекции фага-хозяина, и включает в себя инъекцию генетического материала фага внутрь бактерии. Проникновение нуклеиновой кислоты происходит после необратимой фазы адсорбции. Механизмы, связанные с проникновением нуклеиновой кислоты фага, специфичны для каждого фага. Этот механизм проникновения может включать электрохимический потенциал мембраны, молекулы АТФ, ферментативное расщепление пептидогликанового слоя или все три этих фактора могут быть необходимы для проникновения нуклеиновой кислоты внутрь бактериальной клетки. Исследования механизма проникновения бактериофага T2 (фага, подобного T4) показали, что хвост фага не проникает внутрь бактериальной клеточной стенки, а проникновение этого фага включает электрохимический мембранный потенциал на внутренней мембране.
Репликация и упаковка
Геном вируса T4 синтезируется в клетке-хозяине посредством репликации с использованием схемы "катящегося круга". В период экспоненциального увеличения ДНК при 37 °C скорость составляла 749 нуклеотидов в секунду. Частота мутаций на пару оснований за одну репликацию при синтезе ДНК вируса T4 составляет 1,7 × 10−8, что является высокоточным механизмом копирования ДНК, с одной ошибкой всего на 300 копий. Вирус также кодирует уникальные механизмы репарации ДНК. Головка фага T4 собирается пустой, вокруг белка-каркаса, который впоследствии разрушается. Следовательно, ДНК должна проникать в проголовку через крошечное отверстие, что достигается за счет гексамера gp17, который сначала взаимодействует с ДНК, а затем функционирует как мотор и нуклеаза. Было установлено, что мотор упаковки ДНК T4 способен загружать ДНК в вирусные капсиды со скоростью до 2000 пар оснований в секунду. Мощность этого процесса, если бы она была увеличена в масштабе, была бы эквивалентна мощности двигателя среднего автомобиля.
Релиз
Окончательный этап размножения и размножения вируса определяется высвобождением вирионов из клетки-хозяина. Высвобождение вирионов происходит после разрушения плазматической мембраны бактерии. Необолочковые вирусы лизируют клетку-хозяина, что характеризуется атакой вирусных белков на пептидогликан или мембрану. Лизис бактерии происходит, когда капсиды внутри клетки высвобождают фермент лизоцим, который разрушает клеточную стенку. Высвобожденные бактериофаги заражают другие клетки, и цикл вирусного размножения повторяется в этих клетках.
Реактивация множественности
Реактивация множественности (MR) – это процесс, при котором два или более генома вируса, каждый из которых содержит повреждение генома, вызывающее инактивацию, могут взаимодействовать внутри инфицированной клетки, образуя жизнеспособный геном вируса. Сальвадор Лурия, изучая вирус T4, облученный ультрафиолетом, в 1946 году, обнаружил MR и предположил, что наблюдаемая реактивация поврежденного вируса происходит посредством механизма рекомбинации (см. ссылки). Это произошло до подтверждения ДНК в качестве генетического материала в 1952 году для родственного вируса T2 в эксперименте Херши–Чейза (см. стр. 97). Открытие реактивации облученного вируса (именуемой "реактивацией множественности") сразу же стимулировало активные исследования восстановления радиационных повреждений в ранней фаговой группе (обзор Бернштейна и этилметансульфоната (EMS)). Первый из этих механизмов восстанавливает ДНК с высокой эффективностью (в "плече" кривой дозы), но его способность насыщается с увеличением повреждений; второй путь функционирует при любом уровне повреждений. Выжившие вирусы T4, высвобождаемые из мультикомплексов, не демонстрируют увеличения частоты мутаций, что указывает на то, что MR вируса, облученного УФ-излучением, является точным процессом. Он кодирует белок, обладающий трехмерной структурной гомологией с RecA из Escherichia coli и гомологичным белком RAD51 у эукариот и RadA у архей. Предполагается, что эффективное и точное рекомбинационное восстановление повреждений ДНК во время MR может быть аналогично процессу рекомбинационного восстановления, происходящему во время мейоза у эукариот.
История
Бактериофаги были впервые обнаружены английским ученым Фредериком Твортом в 1915 году и Феликсом д’Эрелем в 1917 году. В конце 1930-х годов Т. Л. Ракитен предложил двум исследователям, Милиславу Демерецу и Уго Фано, либо смесь сырой канализации, либо лизат из *E. coli*, инфицированной сырой канализацией. Эти два исследователя выделили Т3, Т4, Т5 и Т6 из *E. coli*. Также в 1932 году исследователь Дж. Бронфенбреннер изучал и работал над фагом T2, при этом фаг T2 был изолирован из вируса. Эта изоляция была получена из фекального материала, а не из канализации. В любом случае, Макс Дельбрюк был вовлечен в открытие Т-четных фагов. Его роль заключалась в присвоении бактериофагам наименований типа 1 (T1), типа 2 (T2), типа 3 (T3) и т.д. Точное время и место изоляции вируса T4 остаются неясными, хотя, вероятно, они были обнаружены в сточных водах или фекальных материалах. T4 и подобные вирусы были описаны в статье Томаса Ф. Андерсона, Макса Дельбрюка и Милислава Демерека в ноябре 1944 года. В 1943 году Сальвадор Лурия и Дельбрюк показали, что бактериальные мутации, обеспечивающие устойчивость к фагам, возникают в отсутствие селекции, а не как ответ на нее. (Все трое получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1969 году «за работы по механизму репликации и генетике вирусов»). Фаговая группа представляла собой неформальную сеть биологов, центром которой был Макс Дельбрюк, проводившая фундаментальные исследования в основном на бактериофаге T4 и внесшая многочисленные важные вклады в микробиологическую генетику и истоки молекулярной биологии в середине 20-го века. В 1961 году Сидни Бреннер, один из первых членов фаговой группы, сотрудничал с Фрэнсисом Криком, Лесли Барнеттом и Ричардом Уоттсом Тобином в Лаборатории Кавендиша в Кембридже для проведения генетических экспериментов, продемонстрировавших фундаментальную природу генетического кода для белков. Эти эксперименты, проведенные с мутантами гена *rIIB* фага T4, показали, что для гена, кодирующего белок, три последовательных основания ДНК гена определяют каждую последующую аминокислоту белка. Таким образом, генетический код является триплетным кодом, где каждый триплет (называемый кодоном) определяет определенную аминокислоту. Они также получили доказательства того, что кодоны не перекрываются друг с другом в последовательности ДНК, кодирующей белок, и что такая последовательность считывается с фиксированной начальной точки. В период с 1962 по 1964 год исследователи фага T4 предоставили возможность изучить функцию практически всех генов, необходимых для роста фага в лабораторных условиях. Эти исследования были облегчены открытием двух классов условных летальных мутантов. Один класс таких мутантов известен как янта́рные мутанты. Другой класс условных летальных мутантов называется чувствительными к температуре. Изучение этих двух классов мутантов привело к значительному пониманию многих фундаментальных биологических проблем. Таким образом, было получено понимание функций и взаимодействий белков, используемых в механизме репликации, репарации и рекомбинации ДНК, а также того, как вирусы собираются из белковых и нуклеиновых компонентов (молекулярный морфогенез). Кроме того, была выяснена роль терминальных кодонов. В одном из исследований использовались янта́рные мутанты с дефектом в гене, кодирующем основной головной белок фага T4. Этот эксперимент предоставил убедительные доказательства широко распространенной, но до 1964 года все еще недоказанной «гипотезы последовательности», согласно которой аминокислотная последовательность белка определяется нуклеотидной последовательностью гена, определяющего белок. Таким образом, это исследование продемонстрировало колинейность гена с его кодируемым белком. Ряд лауреатов Нобелевской премии работали с вирусом T4 или T4-подобными вирусами, в том числе Макс Дельбрюк, Сальвадор Лурия, Альфред Херши, Джеймс Д. Уотсон и Фрэнсис Крик. Другие важные ученые, работавшие с вирусом T4, включают Майкла Россмана, Сеймура Бензера, Брюса Альбертса, Жизелу Мозиг, Ричарда Ленски и Джеймса Булла.