Введение

Общее применение иммуноокрашивания

Иммуногистохимия (IHC) является формой иммуноокрашивания. Она включает в себя процесс селективной идентификации антигенов (белков) в клетках и тканях, основанный на принципе специфического связывания антител с антигенами в биологических тканях. Альберт Хьюетт Куунс, Эрнест Берлинер, Норман Джонс и Хью Дж. Крич впервые разработали иммунофлуоресценцию в 1941 году, что впоследствии привело к развитию иммуногистохимии. Иммуногистохимическое окрашивание широко используется в диагностике аномальных клеток, например, в раковых опухолях. В некоторых раковых клетках экспрессируются определенные опухолевые антигены, что позволяет их выявлять. Иммуногистохимия также широко применяется в фундаментальных исследованиях для изучения распределения и локализации биомаркеров и дифференциально экспрессируемых белков в различных частях биологической ткани.

Подготовка образца

IHC может быть выполнен на ткани, зафиксированной и залитой в парафин, а также на криоконсервированной (замороженной) ткани. В зависимости от способа сохранения ткани, существуют различные этапы подготовки ткани к IHC, но общая методика включает в себя правильную фиксацию, реактивацию антигена, инкубацию с первичным антителом, а затем инкубацию со вторичным антителом.

Подготовка тканей и фиксация

Фиксация ткани важна для её сохранения и поддержания клеточной морфологии. Состав фиксатора, соотношение фиксатора к ткани и время фиксации влияют на результат. В качестве раствора для фиксации (фиксатива) часто используют 10% нейтральный забуференный формалин (NBF). Обычно ткань фиксируют в течение 24 часов при комнатной температуре. Соотношение фиксатора к ткани варьируется от 1:1 до 1:20. После фиксации ткань можно заливать в парафин. Ткани, залитые в парафин, необходимо депарафинировать для удаления парафина с образца ткани и вокруг него с помощью ксилола или подходящей альтернативы, с последующей обработкой спиртом.

Поиск антигена

Иногда требуется ретрив антигена, чтобы сделать эпитопы в ткани доступными. Эпитопы – это участки связывания антител, используемых для визуализации целевой структуры, и они могут быть замаскированы в результате фиксации. Фиксация ткани может приводить к образованию метиленовых мостиков или сшиванию аминогрупп, в результате чего эпитопы становятся недоступными. Наиболее распространенным методом ретрива антигена является теплоиндуцированный ретрив эпитопов (HIER). Его можно проводить различными способами, например, с использованием микроволновой печи, автоклава, нагревательных пластин или водяных бань. Для криостатных срезов ретрив антигена обычно не требуется, но для криостатных срезов, зафиксированных в ацетоне или нейтральном формалине, ретрив антигена может усилить сигнал иммуногистохимической реакции (IHC).

Типы антител

Антитела, используемые для детекции, могут быть поликлональными или моноклональными. Поликлональные антитела получают, используя животных, таких как морская свинка, кролик, мышь, крыса или коза. Животному вводят антиген, вызывающий иммунный ответ. Антитела выделяют из цельной сыворотки животного. Производство поликлональных антител приводит к смеси различных антител, распознающих несколько эпитопов. Моноклональные антитела получают путем введения животному интересующего антигена, а затем выделения В-клетки, продуцирующей антитела, обычно из селезенки. Затем эту клетку сливают с раковой клеточной линией. Это обеспечивает специфичность антител к одному эпитопу. Для иммуногистохимических методов детекции антитела классифицируются как первичные или вторичные реагенты. Первичные антитела вырабатываются против интересующего антигена и обычно не конъюгированы (не мечены). Вторичные антитела вырабатываются против иммуноглобулинов вида, из которого получены первичные антитела. Вторичное антитело обычно конъюгировано с линкерной молекулой, такой как биотин, которая затем рекрутирует репортерные молекулы, либо само вторичное антитело напрямую связано с репортерной молекулой. При иммунофлуоресценции антитело конъюгируют с флюорофором, таким как флюоресцеин-изотиоцианат (FITC), тетраметилродаминовый изотиоцианат (TRITC), аминометилкумарин ацетат (AMCA) или цианин5 (Cy5). Также часто используются синтетические фторхромы серии Alexa Fluors. Флуорохромы визуализируют с помощью флуоресцентного или конфокального микроскопа.

Устранение неполадок

В иммуногистохимических методах существует несколько этапов перед окончательным окрашиванием ткани, которые могут вызывать различные проблемы. Это может быть сильное окрашивание фона, слабое окрашивание целевого антигена и наличие артефактов. Важно оптимизировать качество антител и сами методы иммуногистохимии. Эндогенный биотин, репортерные ферменты или перекрестная реактивность первичных/вторичных антител – частые причины сильного окрашивания фона. В последнее время иммуногистохимические методы оказались полезны в дифференциальной диагностике различных форм рака слюнных желез, головы и шеи. Разнообразие IHC-маркеров, используемых в диагностической хирургической патологии, значительно. Многие клинические лаборатории в крупных больницах располагают перечнем из более чем 200 антител, используемых в качестве диагностических, прогностических и предиктивных биомаркеров. Примеры часто используемых маркеров включают: BrdU: используется для идентификации пролиферирующих клеток. Применяется для выявления опухолей, а также в нейробиологических исследованиях. Цитокератины: используются для идентификации карцином, но могут также экспрессироваться в некоторых саркомах. CD15 и CD30: используются для диагностики болезни Ходжкина. Альфа-фетопротеин: для опухолей желточного мешка и гепатоцеллюлярной карциномы. CD117 (KIT): для опухолей желудочно-кишечного строма (GIST) и опухолей тучных клеток. CD10 (CALLA): для карциномы почечных клеток и острого лимфобластного лейкоза. Простатспецифический антиген (PSA): для рака простаты. Окрашивание по эстрогеновым и прогестероновым рецепторам (ER & PR) используется как в диагностических целях (опухоли молочной железы и гинекологические опухоли), так и для прогноза рака молочной железы и предсказания ответа на терапию (эстрогеновые рецепторы). Идентификация B-клеточных лимфом с помощью CD20. Идентификация T-клеточных лимфом с помощью CD3. Коктейль PIN 4, нацеленный на p63, CK 5, CK 14 и AMACR (также известный как P504S), используется для дифференциации аденокарциномы простаты от доброкачественных желез.

Направление терапии

Различные молекулярные пути изменяются при раке, и некоторые из этих изменений могут служить мишенями для терапии рака. Иммуногистохимия может быть использована для оценки вероятной чувствительности опухолей к терапии, путем выявления наличия или повышенного уровня молекулярной мишени.

Химические ингибиторы

Биология опухоли позволяет выявить ряд потенциальных внутриклеточных мишеней. Многие опухоли гормонозависимы. Наличие гормональных рецепторов может быть использовано для определения потенциальной чувствительности опухоли к антигормональной терапии. Одним из первых препаратов была антиэстроген тамоксифен, применяемый для лечения рака молочной железы. Такие гормональные рецепторы можно обнаружить с помощью иммуногистохимического исследования. Иматиниб, внутриклеточный ингибитор тирозинкиназы, был разработан для лечения хронического миелолейкоза – заболевания, характеризующегося образованием специфической аномальной тирозинкиназы. Иматиниб оказался эффективен при опухолях, экспрессирующих другие тирозинкиназы, в частности KIT. Большинство желудочно-кишечных стромальных опухолей экспрессируют KIT, который также может быть обнаружен иммуногистохимическим исследованием.

Моноклональные антитела

Многие белки, повышенная экспрессия которых в патологических состояниях подтверждена иммуногистохимическим анализом, являются потенциальными мишенями для терапии с использованием моноклональных антител. Моноклональные антитела, благодаря своим размерам, применяются для воздействия на мишени, расположенные на поверхности клеток. Среди переэкспрессированных мишеней – члены семейства EGFR, трансмембранные белки с внеклеточным рецепторным доменом, регулирующим внутриклеточную тирозинкиназу. Первым из них был разработан HER2/neu (также известный как Erb B2). Эта молекула высоко экспрессируется в различных типах раковых клеток, особенно в раке молочной железы. Соответственно, антитела к HER2/neu одобрены FDA для клинического лечения рака под торговым названием Herceptin. В продаже имеются коммерческие иммуногистохимические тесты, такие как Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle и Ventana Pathway. Аналогично, EGFR (HER 1) также переэкспрессируется при различных видах рака, включая рак головы и шеи, а также рак толстой кишки. Иммуногистохимия используется для выявления пациентов, которым может быть полезна терапия антителами, например, Erbitux (цетуксимаб). Коммерческие системы для определения уровня EGFR методом иммуногистохимии включают Dako pharmDx.

Картографирование экспрессии белка

Иммуногистохимию также можно использовать для более широкого профилирования белков, при условии наличия антител, валидированных для иммуногистохимического анализа. Атлас белков человека представляет собой карту экспрессии белков в нормальных органах и тканях человека. Сочетание иммуногистохимии и тканевых микрочипов позволяет изучать паттерны экспрессии белков в большом количестве различных типов тканей. Иммуногистохимия также применяется для профилирования белков при наиболее распространенных формах рака человека.