Кіріспе

Иммуноқорықтандырудың жалпы қолданылуы

Иммуногистохимия (IHC) иммуноқорықтандырудың бір түрі болып табылады. Ол биологиялық тіндердегі антигендерге (ақуыздарға) ерекше байланысатын антиденелер принципін пайдалану арқылы жасушалар мен тіндердегі антигендерді іріктеп анықтау процесін қамтиды. Альберт Хьюетт Куонс, Эрнест Берлинер, Норман Джонс және Хью Дж. Крич 1941 жылы алғаш рет иммунофлуоресценцияны жасады. Бұл кейін иммуногистохимияның дамуына әкелді. Иммуногистохимиялық бояу қатерлі ісіктердегі аномальді жасушаларды диагностикалауда кеңінен қолданылады. Кейбір қатерлі ісік жасушаларында белгілі бір ісік антигендері экспрессияланады, бұл оларды анықтауға мүмкіндік береді. Иммуногистохимия сонымен қатар негізгі зерттеулерде де кеңінен қолданылады, биологиялық тіндердің әртүрлі бөліктеріндегі биомаркерлер мен әртүрлі экспрессияланатын ақуыздардың таралуын және орналасуын түсінуге көмектеседі.

Үлгілерді дайындау

IHC парафинге бекітілген және енгізілген тіндерде, сондай-ақ криоконсервіленген (мұздатылған) тіндерде де жүргізілуі мүмкін. Тіннің сақталу тәсіліне қарай, IHC-ге дайындау үшін әртүрлі қадамдар қарастырылады, бірақ жалпы әдіс дұрыс бекіту, антигенді іздеу инкубациясы біріншілік антителомен, содан кейін екіншілік антителомен инкубацияны қамтиды.

Тіндерді дайындау және бекіту

Тіннің бекітілуі тінді сақтау және жасушалық морфологияны сақтау үшін маңызды. Фиксация формуласы, фиксативтің тінге қатынасы және фиксативте ұстау уақыты нәтижеге әсер етеді. Фиксациялық ерітінді (фиксатив) көбінесе 10% бейтарап буферлі формалиннен (NBF) тұрады. Қалыпты бекіту уақыты бөлме температурасында 24 сағатты құрайды. Фиксатив пен тіннің арақатынасы 1:1-ден 1:20-ға дейін ауытқуы мүмкін. Тін бекітілгеннен кейін оны парафинге салуға болады. Парафинге сіңген тіндерді ксилен немесе оның жақсы баламасымен парафинден тазарту қажет, содан кейін спирт қолданылады.

Антигенді алу

Кейде тіндердегі эпитоптарды анықтау үшін антигенді алу қажет болады. Эпитоптар – нысананы көруге қолданылатын антиденелердің байланысу орындары, және бекіту процесінен кейін олар жасырынып қалуы мүмкін. Тіннің бекітілуі метилендік байланыстардың түзілуіне немесе аминтоптардың өзара байланысуына себеп болуы мүмкін, соның салдарынан эпитоптар қолжетімсіз болып қалады. Антигенді алудың ең көп қолданылатын әдісі – жылумен шақырылған эпитоптық алу (HIER). Бұл микротолқынды пештер, автоклавтар, қыздыру тақталары немесе су ванналары сияқты әртүрлі тәсілдермен жүзеге асырылуы мүмкін. Мұздатылған тіндер үшін антигенді алу көбінесе қажет емес, бірақ ацетон немесе NBF-те бекітілген мұздатылған тіндерде антигенді алу IHC сигналын жақсартуы мүмкін.

Антитело түрлері

Анықтауға қолданылатын антиденелер поликлоналдық немесе моноклоналдық болуы мүмкін. Поликлоналдық антиденелер теңіз шошқасы, қоян, егеуқұйрық, тышқан немесе ешкі сияқты жануарларды пайдалану арқылы жасалады. Жануарға қызығушылық тудыратын антиген енгізіледі, бұл иммундық жауапты тудырады. Антиденелерді жануардың толық сарысуынан бөліп алуға болады. Поликлоналдық антиденелерді өндіру әртүрлі антиденелердің қоспасын құрайды және бірнеше эпитопты таниды. Моноклоналдық антиденелер жануарға қызығушылық тудыратын антигенді енгізу және одан кейін, әдетте, сілекейден антидене шығаратын В-жасушасын бөліп алу арқылы жасалады. Антидене шығаратын жасуша кейін қатерлі жасушамен біріктіріледі. Бұл антиденелердің бір ғана эпитопқа қатысты ерекшеліктерін көрсетеді. Иммуногистохимиялық анықтау стратегиялары үшін антиденелер біріншілік немесе екіншілік реагенттер ретінде жіктеледі. Біріншілік антиденелер қызығушылық тудыратын антигенге қарсы жасалады және әдетте конъюгацияланбайды (белгіленбейді). Екіншілік антиденелер біріншілік антидене түрінің иммуноглобулиндеріне қарсы жасалады. Екіншілік антидене әдетте репортер молекулаларын тартатын биотин сияқты байланыстыратын молекуламен конъюгацияланады немесе екіншілік антидене өзі тікелей репортер молекуласымен байланысады. Иммунофлуоресценцияда антидене флуороформен таңбаланады, мысалы, флуоресцеин изотиоцианаты (FITC), тетраметилродамин изотиоцианаты (TRITC), аминометил кумарин ацетаты (AMCA) немесе цианин5 (Cy5). Сондай-ақ, Alexa Fluors синтетикалық флуорохромдары да жиі қолданылады. Флуорохромдар флуоресценциялық немесе конфокалды микроскоппен көрінеді.

Қателерді жою

Иммуногистохимиялық әдістерде тінді соңғы бояуға дейін бірнеше қадамдар бар, олар түрлі проблемаларды тудыруы мүмкін. Бұл күшті фондық бояу, әлсіз нысаналық антигендік бояу және артефакттардың пайда болуы болуы мүмкін. Антиденелердің сапасы мен ИГХ әдістерін оңтайландыру маңызды. Эндогенді биотин, репортерлік ферменттер немесе біріншілік/екіншілік антиденелердің қиылысу реакциясы – күшті фондық бояудың жиі кездесетін себептері. Соңғы уақытта иммуногистохимиялық әдістер сілекей безінің, бас және мойын карциномаларының көптеген түрлерін ажырату диагностикасында пайдалы болды. Диагностикалық хирургиялық патологияда қолданылатын ИГХ маркерлерінің әртүрлілігі зор. Көптеген клиникалық зертханаларда диагностикалық, прогностикалық және болжамдық биомаркерлер ретінде қолданылатын 200-ден астам антиденелердің тізімі бар. Кейбір жиі қолданылатын маркерлердің мысалдары: BrdU: көбейіп жатқан жасушаларды анықтау үшін қолданылады. Ол ісіктерді анықтау үшін, сондай-ақ нейроғылымдағы зерттеулерде қолданылады. Цитокератиндер: карциномаларды анықтау үшін қолданылады, бірақ кейбір саркомаларда да экспрессиялануы мүмкін. CD15 және CD30: Ходжкин ауруы үшін қолданылады. Альфа-фетопротеин: сары қапшықтың ісіктері және гепатоклеткалық карцинома үшін. CD117 (KIT): асқазан-ішек астындағы стромалық ісіктер (GIST) және мастоцитарлық ісіктер үшін. CD10 (CALLA): бүйрек клеткалық карциномасы және жіті лимфобластық лейкемия үшін. Простатаға тән антиген (PSA): простата қатерлі ісігі үшін. Эстрогендер мен прогестерон рецепторларын (ER & PR) бояу диагностикалық (сүт және гинекологиялық ісіктер) және сүт қатерлі ісігінің прогностикалық және терапияға (эстроген рецепторлары) жауап беруін болжау үшін қолданылады. CD20 қолдану арқылы B-жасушалы лимфомаларды анықтау. CD3 көмегімен T-жасушалы лимфомаларды анықтау. PIN 4 коктейлі, p63, CK 5, CK 14 және AMACR (соңғысы P504S деп те аталады) нысанасы болып табылады және простата аденокарциномын қалыпты бездерден ажырату үшін қолданылады.

Терапияны басқару

Қатерлі ісіктерде әртүрлі молекулалық жолдар өзгереді, ал кейбір өзгерістерді қатерлі ісіктерді емдеуде мақсаттауға болады. Иммуногистохимия молекулалық нысананың болуын немесе оның деңгейінің жоғарылауын анықтау арқылы, қай ісіктер емге жақсы жауап беретінін бағалау үшін қолданылуы мүмкін.

Химиялық ингибиторлар

Оғрық биологиясы бірнеше потенциалды жасуша ішіндегі нысаналарды анықтауға мүмкіндік береді. Көптеген ісіктер гормондарға тәуелді болады. Гормондық рецепторлардың болуын пайдаланып, ісіктің антигормоналды терапияға сезімталдығын анықтауға болады. Бірінші терапиялардың бірі – емінегі қатерлі ісігін емдеу үшін қолданылатын антиэстроген, тамоксифен. Мұндай гормондық рецепторларды иммуногистохимия арқылы анықтауға болады. Хроникалық миелогенді лейкозды емдеу үшін жасуша ішіндегі тирозинкиназа ингибиторы – иматиниб әзірленді, бұл ауру ерекше аномальды тирозинкиназаның пайда болуымен сипатталады. Иматиниб басқа тирозинкиназаларды экспрессиялайтын ісіктерде, ең бастысы KIT-те тиімді екені дәлелденді. Асқазан-ішек трактісінің көптеген стромалық ісіктері KIT-ті экспрессиялайды, оны иммуногистохимия арқылы анықтауға болады.

Моноклоналды антиденелер

Көптеген ақуыздар, иммуногистохимиялық зерттеулерде патологиялық жағдайларда жоғары реттелуі көрсетілген, моноклональды антиденелерді қолданатын терапия үшін әлеуетті нысаналар болып табылады. Моноклональды антиденелер, олардың мөлшеріне байланысты, жасуша бетіндегі нысаналарға қарсы қолданылады. Шамадан тыс экспрессияланатын нысаналардың арасында ЭФГР отбасының мүшелері бар – жасуша ішіндегі тирозинкиназаны реттейтін сыртқы рецепторлық домені бар трансмембраналық ақуыздар. Олардың ішінде HER2/neu (Erb B2 деп те аталады) ең бірінші әзірленді. Бұл молекула әртүрлі қатерлі жасуша түрлерінде, ең әсіресе сүт безі қатерлі ісігінде жоғары экспрессияланады. Осылайша, HER2/neu-ге қарсы антиденелер Herceptin атты дәрілік препарат ретінде қатерлі ісіктің клиникалық емдеуі үшін FDA-мен бекітілді. Dako HercepTest, Leica Biosystems Oracle және Ventana Pathway сияқты коммерциялық иммуногистохимиялық тесттер қолжетімді. Сонымен қатар, EGFR (HER 1) да бас, мойын және тоқ ішек қатерлі ісіктері сияқты түрлі қатерлі ісіктерде шамадан тыс экспрессияланады. Иммуногистохимия Erbitux (cetuximab) сияқты терапиялық антиденелерден пайда көре алатын пациенттерді анықтау үшін қолданылады. EGFR-ді иммуногистохимиялық әдіспен анықтауға арналған коммерциялық жүйелерге Dako pharmDx кіреді.

Белсенің экспрессиясын картаға түсіру

Иммуногистохимия, иммуногистохимиялық зерттеулерге жарамды антиденелер болған жағдайда, жалпы ақуыздық профильдеу үшін де қолданылуы мүмкін. Адам ақуыз атласы – қалыпты адам мүшелері мен тіндеріндегі ақуыз экспрессиясының картасын көрсетеді. Иммуногистохимия және тіндік микромассивтердің үйлесімі әртүрлі көптеген тіндердегі ақуыз экспрессиясының үлгілерін ұсынады. Иммуногистохимия адамдардағы ең көп таралған қатерлі ісік түрлеріндегі ақуыздық профильдеу үшін де қолданылады.