Трипсин: фермент пищеварения и его механизм действия.

Введение

Семья пищеварительных ферментов

Трипсин – это фермент, находящийся в первом отделе тонкой кишки, который начинает переваривание белковых молекул, расщепляя длинные цепочки аминокислот на более короткие фрагменты. Это серинпротеаза из суперсемейства клана PA, обнаруженная в пищеварительной системе многих позвоночных, где она гидролизует белки. Трипсин формируется в тонком кишечнике при активации его проферментной формы – трипсиногена, вырабатываемого поджелудочной железой. Трипсин расщепляет пептидные цепи преимущественно на карбоксильной стороне аминокислот лизина или аргинина. Он используется в многочисленных биотехнологических процессах. Этот процесс обычно называют протеолизом трипсиногена или трипсинизацией, а белки, подвергшиеся перевариванию/обработке трипсином, считаются трипсинизированными. Трипсин был открыт в 1876 году Вильгельмом Кюне и получил своё название от древнегреческого слова, означающего «растирание», поскольку он был впервые выделен путём растирания поджелудочной железы глицерином.

Функция

В двенадцатиперстной кишке трипсин катализирует гидролиз пептидных связей, расщепляя белки на более мелкие пептиды. Эти пептидные продукты затем подвергаются дальнейшему гидролизу до аминокислот при участии других протеаз, что обеспечивает их всасывание в кровоток. Триптическое переваривание является необходимым этапом в усвоении белков, поскольку белки, как правило, слишком велики для всасывания через слизистую оболочку тонкого кишечника. Трипсин синтезируется в поджелудочной железе в виде неактивного предшественника – трипсиногена. При стимуляции поджелудочной железы холецистокинином, трипсиноген секретируется в начальный отдел тонкой кишки (двенадцатиперстную кишку) через панкреатический проток. Попав в тонкий кишечник, фермент энтерокиназа (также называемый энтеропептидазой) активирует трипсиноген в трипсин посредством протеолитического расщепления. Затем трипсин активирует дополнительный трипсин, химотрипсин и карбоксипептидазу.

Механизм

Ферментативный механизм аналогичен механизму других серин-протеаз. Эти ферменты содержат каталитическую триаду, состоящую из гистидина 57, аспартата 102 и серина 195. Эта каталитическая триада ранее называлась системой реле заряда, подразумевая отрыв протонов от серина к гистидину и от гистидина к аспартату, но, благодаря данным, полученным методом ЯМР, свидетельствующим о том, что алкоксидная форма серина будет иметь значительно большее сродство к протону, чем имидазольное кольцо гистидина, современная точка зрения заключается в том, что серин и гистидин в равной степени участвуют в обмене протоном, формируя с ним короткие водородные связи с низким энергетическим барьером. Таким образом, нуклеофильность серина в активном центре увеличивается, что облегчает его атаку на амидный углерод во время протеолиза. Ферментативная реакция, катализируемая трипсином, термодинамически благоприятна, но требует значительной энергии активации (то есть является "кинетически неблагоприятной"). Кроме того, трипсин содержит "оксианионное углубление", образованное атомами водорода амидной группы Gly 193 и Ser 195, которые посредством водородных связей стабилизируют отрицательный заряд, накапливающийся на амидном кислороде после нуклеофильной атаки кислородом серина на плоский амидный углерод, что приводит к переходу углерода в тетраэдрическую геометрию. Такая стабилизация этого тетраэдрического интермедиата способствует снижению энергетического барьера его образования и сопровождается уменьшением свободной энергии переходного состояния. Преференциальное связывание переходного состояния является ключевой особенностью ферментативной химии. Отрицательно заряженный остаток аспартата (Asp 189), расположенный в каталитическом кармане (S1) трипсина, отвечает за притяжение и стабилизацию положительно заряженных лизина и/или аргинина и, следовательно, определяет специфичность фермента. Это означает, что трипсин преимущественно расщепляет белки на карбоксильной стороне (или "С-концевой стороне") аминокислот лизина и аргинина, за исключением случаев, когда один из них связан с C-концевым пролином, хотя масштабные данные масс-спектрометрии указывают на то, что расщепление происходит даже при наличии пролина. Трипсин считается эндопептидазой, то есть расщепление происходит внутри полипептидной цепи, а не на концевых аминокислотах, расположенных на концах полипептидов.

The enzymatic mechanism is similar to that of other serine proteases. These enzymes contain a catalytic triad consisting of histidine 57, aspartate 102, and serine 195. This catalytic triad was formerly called a charge relay system, implying the abstraction of protons from serine to histidine and from histidine to aspartate, but owing to evidence provided by NMR that the resultant alkoxide form of serine would have a much stronger pull on the proton than does the imidazole ring of histidine, current thinking holds instead that serine and histidine each have effectively equal share of the proton, forming short low barrier hydrogen bonds therewith. By these means, the nucleophilicity of the active site serine is increased, facilitating its attack on the amide carbon during proteolysis. The enzymatic reaction that trypsin catalyzes is thermodynamically favorable, but requires significant activation energy (it is "kinetically unfavorable"). In addition, trypsin contains an "oxyanion hole" formed by the backbone amide hydrogen atoms of Gly 193 and Ser 195, which through hydrogen bonding stabilize the negative charge which accumulates on the amide oxygen after nucleophilic attack on the planar amide carbon by the serine oxygen causes that carbon to assume a tetrahedral geometry. Such stabilization of this tetrahedral intermediate helps to reduce the energy barrier of its formation and is concomitant with a lowering of the free energy of the transition state. Preferential binding of the transition state is a key feature of enzyme chemistry. The negative aspartate residue (Asp 189) located in the catalytic pocket (S1) of trypsin is responsible for attracting and stabilizing positively charged lysine and/or arginine, and is, thus, responsible for the specificity of the enzyme. This means that trypsin predominantly cleaves proteins at the carboxyl side (or "C terminal side") of the amino acids lysine and arginine except when either is bound to a C terminal proline, although large scale mass spectrometry data suggest cleavage occurs even with proline. Trypsin is considered an endopeptidase, i. e., the cleavage occurs within the polypeptide chain rather than at the terminal amino acids located at the ends of polypeptides.

Свойства

Оптимальная рабочая температура трипсина человека составляет около 37 °C. В отличие от этого, у атлантической трески имеется несколько типов трипсинов, позволяющих этой рыбе, относящейся к группе холоднокровных, выживать при различных температурах тела. Трипсины трески включают трипсин I с диапазоном активности от 4 до 65 °C (40 до 150 °F) и максимальной активностью при 55 °C (130 °F), а также трипсин Y с диапазоном активности от 2 до 30 °C (36 до 86 °F) и максимальной активностью при 21 °C (70 °F). Как белок, трипсин имеет различные молекулярные массы в зависимости от источника. Например, для трипсина, полученного из коров и свиней, сообщается о молекулярной массе 23,3 кДа. На активность трипсина не оказывает влияния ингибитор фермента тозилфенилаланилхлорометилкетон (TPCK), который деактивирует химотрипсин. Трипсин следует хранить при очень низких температурах (от -20 до -80 °C), чтобы предотвратить аутолиз, который также может быть замедлен хранением трипсина при pH 3 или использованием трипсина, модифицированного редуктивным метилированием. При восстановлении pH до 8 активность восстанавливается.

Клиническое значение

Активация трипсина в результате протеолитического расщепления трипсиногена в поджелудочной железе может привести к каскаду событий, вызывающих самопереваривание поджелудочной железы и, как следствие, панкреатит. Одним из последствий аутосомно-рецессивного заболевания – кистозного фиброза – является дефицит транспорта трипсина и других пищеварительных ферментов из поджелудочной железы. Это приводит к развитию состояния, называемого мекониевым илеусом, характеризующегося кишечной непроходимостью (илеусом) из-за чрезмерно густого мекония, который в норме расщепляется трипсином и другими протеазами и выводится с калом.

Приложения

Трипсин в большом количестве содержится в поджелудочной железе и может быть очищен довольно легко. Поэтому он широко используется в различных биотехнологических процессах. В лаборатории культивирования тканей трипсин используется для ресуспендирования клеток, прикрепленных к стенке чашки для клеточной культуры, во время сбора клеток. Некоторые типы клеток прикрепляются к стенкам и дну чашки при культивировании in vitro. Трипсин используется для расщепления белков, удерживающих культивируемые клетки на чашке, чтобы клетки можно было отделить от пластины. Трипсин также может использоваться для диссоциации диссецированных клеток (например, перед фиксацией и сортировкой клеток). Трипсин может быть использован для расщепления казеина в грудном молоке. Если трипсин добавить в раствор молочного порошка, распад казеина приводит к тому, что молоко становится полупрозрачным. Скорость реакции можно измерить, определив время, необходимое для того, чтобы молоко стало полупрозрачным. Трипсин обычно используется в биологических исследованиях во время протеомических экспериментов для расщепления белков на пептиды для анализа масс-спектрометрии, например, при переваривании белков в геле. Трипсин особенно хорошо подходит для этого, поскольку обладает очень четко определенной специфичностью, гидролизуя только пептидные связи, в которых карбонильная группа предоставлена остатком аргинина или лизина. Трипсин также может использоваться для растворения кровяных сгустков в своей микробной форме и для лечения воспаления в своей панкреатической форме. В ветеринарной медицине трипсин входит в состав ранозаживляющих спреев, таких как Дебрисол, для растворения мертвой ткани и гноя в ранах лошадей, крупного рогатого скота, собак и кошек.

Ингибитор трипсина

Чтобы предотвратить действие активного трипсина в поджелудочной железе, которое может нанести серьезный вред, в качестве защиты от его нежелательной активации присутствуют такие ингибиторы, как BPTI и SPINK1 в поджелудочной железе и α1-антитрипсин в сыворотке крови. Любой трипсин, преждевременно образовавшийся из неактивного трипсиногена, затем связывается с ингибитором. Взаимодействие белок-белок между трипсином и его ингибиторами является одним из самых прочных, и трипсин связывается с некоторыми ингибиторами поджелудочной железы почти необратимо. В отличие от подавляющего большинства известных белковых комплексов, некоторые комплексы трипсина, связанные с его ингибиторами, не легко диссоциируют после обработки 8M мочевиной. Ингибиторы трипсина могут служить инструментами при изучении метаболических расстройств и ожирения. Известно, что метаболические нарушения, ожирение и избыточный вес повышают распространенность неинфекционных хронических заболеваний. В интересах политики здравоохранения важно изучить различные способы смягчения этой тенденции, включая использование ингибиторов трипсина. Эти ингибиторы способны снижать риск развития рака толстой кишки, молочной железы, кожи и простаты благодаря радиопротекторной и противораковой активности. Ингибиторы трипсина могут выступать в качестве регуляторных механизмов для контроля высвобождения протеаз нейтрофилов и предотвращения значительного повреждения тканей. Хотя механизмы антибактериального действия ингибиторов трипсина остаются неясными, исследования направлены на изучение этих механизмов с целью их потенциального применения в лечении бактериальных инфекций. Однако Accutase снижает поверхностные уровни FasL и Fas-рецепторов на макрофагах, эти рецепторы связаны с клеточной цитотоксичностью в иммунной системе и могут также способствовать апоптотической гибели клеток. ProAlanase также может служить альтернативой трипсину в протеомных исследованиях. ProAlanase – это протеаза гриба Aspergillus niger, способная достигать высокой протеолитической активности и специфичности при переваривании в оптимальных условиях. ProAnalase, кислотная пролилэндопептидаза, ранее изучавшаяся как An PEP, была исследована в различных экспериментах для определения ее специфичности. ProAnalase демонстрирует оптимальную эффективность в LC-MS при коротком времени переваривания и сильнокислой pH.

To prevent the action of active trypsin in the pancreas, which can be highly damaging, inhibitors such as BPTI and SPINK1 in the pancreas and α1 antitrypsin in the serum are present as part of the defense against its inappropriate activation. Any trypsin prematurely formed from the inactive trypsinogen is then bound by the inhibitor. The protein protein interaction between trypsin and its inhibitors is one of the tightest bound, and trypsin is bound by some of its pancreatic inhibitors nearly irreversibly. In contrast with nearly all known protein assemblies, some complexes of trypsin bound by its inhibitors do not readily dissociate after treatment with 8M urea. Trypsin inhibitors can serve as tools when addressing metabolic and obesity disorders. Metabolic disorders, obesity, and being overweight are known to increase non communicable chronic disease prevalence. It is of public health policy interest to explore various ways to mitigate this occurrence including use of trypsin inhibitors. These inhibitors have capabilities of reducing colon, breast, skin, nad prostate cancer by way of radioprotective and anticarcinogenic activity. Trypsin inhibitors can act as regulatory mechanisms to control release of neutrophil proteases and avoid significant tissue damage. While the antibacterial action mechanisms of trypsin inhibitors are unclear, studies have aimed to study their mechanisms as potential applications in bacterial infection treatments. However Accutase decreases the surface levels of FasL and Fas receptor on macrophages, these receptors are associated with cell cytotoxicity in the immune system and can also facilitate apoptosis related cell death. ProAlanase could also serve as an alternative to Trypsin in proteomic applications. ProAlanase is an Aspergillus niger fungus protease that can achieve high proteolytic activity and specificity for digestion under the correct conditions. ProAnalase, the acidic prolyl endopeptidase protease, previously studied as An PEP, has been observed in various experiments to define its specificity. ProAnalase performed optimally in LC MS applications with short digestion times and highly acidic pH.