Введение
Расщепление белков на более мелкие полипептиды или аминокислоты
Протеолиз – это расщепление белков на более мелкие полипептиды или аминокислоты. Без катализа гидролиз пептидных связей происходит крайне медленно, занимая столетия. Протеолиз обычно катализируется клеточными ферментами, называемыми протеазами, но может также происходить посредством внутримолекулярного расщепления. Протеолиз в организмах выполняет множество функций; например, пищеварительные ферменты расщепляют белки в пище, обеспечивая организм аминокислотами, а протеолитическая обработка полипептидной цепи после ее синтеза может быть необходима для получения активного белка. Он также играет важную роль в регуляции некоторых физиологических и клеточных процессов, включая апоптоз, а также предотвращает накопление нежелательных или неправильно свернутых белков в клетках. Следовательно, нарушение регуляции протеолиза может приводить к заболеваниям. Протеолиз также может использоваться как аналитический инструмент для изучения белков в лаборатории, а также применяться в промышленности, например, в пищевой промышленности и при удалении пятен.
Посттрансляционная протеолитическая обработка
Ограниченный протеолиз полипептида во время или после трансляции в процессе синтеза белка часто происходит для многих белков. Это может включать удаление N-терминального метионина, сигнального пептида и/или превращение неактивного или нефункционального белка в активный. Предшественник конечной функциональной формы белка называется пробелком, а эти пробeлки могут сначала синтезироваться как препробелки. Например, альбумин сначала синтезируется как препроальбумин и содержит нерасщепленный сигнальный пептид. После расщепления сигнального пептида образуется проальбумин, а дальнейшая обработка для удаления N-терминального 6-аминокислотного пропептида приводит к образованию зрелой формы белка.
Удаление N-конца метионина
Инициативный метионин (и, у прокариот, fMet) может быть удален в процессе трансляции нового белка. У *E. coli* fMet эффективно удаляется, если второй аминокислотный остаток мал и незаряжен, но не удаляется, если он объемен и заряжен. Как у прокариот, так и у эукариот, экспонированный N-концевой аминокислотный остаток может определять период полураспада белка согласно правилу N-конца.
Удаление последовательности сигналов
Белки, предназначенные для доставки в определенную органеллу или для секреции, содержат N-концевой сигнальный пептид, который направляет белок к месту его назначения. Этот сигнальный пептид удаляется протеолизом после их транслокации через мембрану.
Расщепление полипротеинов
Некоторые белки и большинство эукариотических полипептидных гормонов синтезируются в виде большого полипептида-предшественника, известного как полипротеин, который требует протеолитического расщепления на отдельные, более мелкие полипептидные цепи. Полипротеин проопиомеланокортина (POMC) содержит множество полипептидных гормонов. Однако схема расщепления POMC может варьироваться в разных тканях, что приводит к образованию различных наборов полипептидных гормонов из одного и того же полипротеина. Многие вирусы также изначально производят свои белки в виде единой полипептидной цепи, транслированной из полицистронической мРНК. Этот полипептид впоследствии расщепляется на отдельные полипептидные цепи. Белки в клетках расщепляются на аминокислоты. Это внутриклеточное разложение белков выполняет несколько функций: оно удаляет поврежденные и аномальные белки, предотвращая их накопление, а также регулирует клеточные процессы, удаляя ферменты и регуляторные белки, которые больше не требуются. Аминокислоты затем могут быть повторно использованы для синтеза белков.
Лизосомы и протеазомы
Внутриклеточная деградация белка может осуществляться двумя путями: протеолизом в лизосоме или убиквитин-зависимым процессом, направляющим нежелательные белки к протеасоме. Автофагия, осуществляемая через лизосомы, обычно является неселективным процессом, но может становиться селективной при голодании, когда белки, содержащие пептидную последовательность KFERQ или аналогичную, избирательно разрушаются. Лизосома содержит большое количество протеаз, таких как катепсины. Убиквитин-зависимый процесс является селективным. Белки, предназначенные для деградации, ковалентно связываются с убиквитином. К белку, предназначенному для разложения, могут быть присоединены множество молекул убиквитина, соединенных последовательно. Полиубиквитинированный белок направляется к АТФ-зависимому протеазному комплексу – протеасоме. Убиквитин высвобождается и используется повторно, а целевой белок подвергается деградации.
Скорость внутриклеточного разложения белков
Различные белки разлагаются с разной скоростью. Аномальные белки быстро разрушаются, в то время как скорость деградации нормальных белков может сильно варьироваться в зависимости от их функций. Ферменты в важных точках метаболического контроля могут разлагаться гораздо быстрее, чем ферменты, чья активность в значительной степени постоянна при всех физиологических условиях. Одним из наиболее быстро разлагающихся белков является орнитиновая декарбоксилаза, период полураспада которой составляет 11 минут. В отличие от этого, другие белки, такие как актин и миозин, имеют период полураспада в месяц и более, тогда как гемоглобин, по сути, существует на протяжении всего срока жизни эритроцита. Правило N-конца может частично определять период полураспада белка, а белки с сегментами, богатыми пролином, глутаминовой кислотой, серином и треонином (так называемые белки PEST), имеют короткий период полураспада. Другие факторы, предположительно влияющие на скорость деградации, включают скорость деаминирования глутамина и аспарагина, а также окисление цистеина, гистидина и метионина, отсутствие стабилизирующих лигандов, наличие присоединенных углеводных или фосфатных групп, наличие свободной α-аминогруппы, отрицательный заряд белка, а также гибкость и стабильность белка, при этом предполагается, что наличие неупорядоченных сегментов способствует эффективному инициированию деградации протеасомой. Скорость протеолиза также может зависеть от физиологического состояния организма, такого как его гормональный статус и питательный статус. В условиях голодания скорость деградации белка увеличивается.
Пищеварение
При пищеварении человека белки в пище расщепляются на более короткие пептидные цепи пищеварительными ферментами, такими как пепсин, трипсин, химотрипсин и эластаза, а также на аминокислоты различными ферментами, такими как карбоксипептидаза, аминопептидаза и дипептидаза. Необходимо расщеплять белки на мелкие пептиды (трипептиды и дипептиды) и аминокислоты для их всасывания в кишечнике, а всосавшиеся трипептиды и дипептиды затем дополнительно расщепляются на аминокислоты внутри клеток перед попаданием в кровоток. Различные ферменты обладают разной специфичностью к своему субстрату: трипсин, например, расщепляет пептидную связь после положительно заряженного остатка (аргинина и лизина); химотрипсин – после ароматического остатка (фенилаланина, тирозина и триптофана); эластаза – после небольшого неполярного остатка, такого как аланин или глицин. Чтобы предотвратить нежелательную или преждевременную активацию пищеварительных ферментов (которые, например, могут вызвать самопереваривание поджелудочной железы, приводящее к панкреатиту), эти ферменты секретируются в виде неактивных зимогенов. Пепсиноген, предшественник пепсина, секретируется желудком и активируется только в кислой среде желудка. Поджелудочная железа секретирует предшественники ряда протеаз, таких как трипсин и химотрипсин. Зимоген трипсина – трипсиноген, который активируется очень специфической протеазой, энтерокиназой, секретируемой слизистой оболочкой двенадцатиперстной кишки. Трипсин, после активации, может также расщеплять другие трипсиногены, а также предшественники других протеаз, таких как химотрипсин и карбоксипептидаза, для их активации. У бактерий используется аналогичная стратегия использования неактивного зимогена или презимогена. Субтилизин, производимый Bacillus subtilis, синтезируется в виде препросубтилизина и высвобождается только после отщепления сигнального пептида и аутокаталитической протеолитической активации.
Регуляция клеточной деятельности
Протеолиз также участвует в регуляции многих клеточных процессов, активируя или деактивируя ферменты, факторы транскрипции и рецепторы, например, в биосинтезе холестерина или в опосредовании тромбиновой сигнализации через рецепторы, активируемые протеазами. Некоторые ферменты в ключевых точках метаболического контроля, такие как орнитиндекарбоксилаза, регулируются исключительно скоростью их синтеза и скоростью деградации. К другим быстро разрушающимся белкам относятся белковые продукты протоонкогенов, играющие центральную роль в регуляции роста клеток.
Регуляция клеточного цикла
Циклины – это группа белков, которые активируют киназы, участвующие в делении клеток. Деградация циклинов является ключевым этапом, определяющим выход из митоза и переход в следующий клеточный цикл. Циклины накапливаются в течение клеточного цикла, а затем резко исчезают непосредственно перед анафазой митоза. Циклины удаляются посредством протеолитического пути, опосредованного убиквитином.
Апоптоз
Каспазы – важная группа протеаз, участвующих в апоптозе, или запрограммированной клеточной смерти. Прекурсоры каспаз, прокаспазы, могут активироваться протеолитическим расщеплением в результате их взаимодействия с белковым комплексом, формирующим апоптосому, гранзимом B или посредством путей, активируемых рецепторами смерти.
Автопротеолиз
Автопротеолиз происходит в некоторых белках, при этом пептидная связь расщепляется в результате самокатализируемой внутримолекулярной реакции. В отличие от зимогенов, эти аутопротеолитические белки участвуют в реакции "одного оборота" и не катализируют дальнейшие реакции после расщепления. Примеры включают расщепление связи Asp-Pro в подмножестве доменов фактора фон Виллебранда типа D (VWD) и домена самообработки FrpC бактерии *Neisseria meningitidis*, расщепление связи Asn-Pro в белке FlhB бактерии *Salmonella*, белке YscU бактерии *Yersinia*, а также расщепление связи Gly-Ser в подмножестве белка спермы морского ежа, энтерокиназы и доменов агрина (SEA). В некоторых случаях аутопротеолитическое расщепление стимулируется конформационным напряжением пептидной связи. При панкреатите утечка протеаз и их преждевременная активация в поджелудочной железе приводит к самоперевариванию поджелудочной железы. У людей с сахарным диабетом может наблюдаться повышенная лизосомная активность, и деградация некоторых белков может значительно усиливаться. Хронические воспалительные заболевания, такие как ревматоидный артрит, могут включать высвобождение лизосомных ферментов во внеклеточное пространство, что приводит к разрушению окружающих тканей. Аномальный протеолиз может приводить к развитию многих возрастных неврологических заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, из-за образования и неэффективного удаления пептидов, которые агрегируют в клетках. Протеазы могут регулироваться антипротеазами или ингибиторами протеаз, а дисбаланс между протеазами и антипротеазами может приводить к заболеваниям, например, к разрушению ткани легких при эмфиземе, вызванной курением табака. Считается, что курение увеличивает количество нейтрофилов и макрофагов в легких, которые высвобождают избыточное количество протеолитических ферментов, таких как эластаза, в результате чего они больше не могут быть ингибированы серпинами, такими как α1-антитрипсин, что приводит к разрушению соединительной ткани в легких. Другие протеазы и их ингибиторы также могут участвовать в этом заболевании, например, матричные металлопротеиназы (ММП) и тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТИМП). Другие заболевания, связанные с аберрантным протеолизом, включают мышечную дистрофию, дегенеративные заболевания кожи, респираторные и желудочно-кишечные заболевания, а также злокачественные новообразования.
Неферментные процессы
Стержневые структуры белков очень стабильны в воде при нейтральном pH и комнатной температуре, хотя скорость гидролиза различных пептидных связей может варьироваться. Период полураспада пептидной связи при нормальных условиях может составлять от 7 лет до 350 лет и даже больше для пептидов, защищенных модифицированным концом или находящихся внутри белка. Однако скорость гидролиза может значительно увеличиваться при экстремальных значениях pH и воздействии высоких температур. Спонтанное расщепление белков также может включать катализ цинком на серине и треонине. Сильные минеральные кислоты легко гидролизуют пептидные связи в белке (кислотный гидролиз). Стандартный способ гидролиза белка или пептида на составляющие его аминокислоты для анализа заключается в нагревании до 105 °C в течение примерно 24 часов в 6M соляной кислоте. Тем не менее, некоторые белки устойчивы к кислотному гидролизу. Хорошо известный пример – рибонуклеаза А, которую можно очистить, обрабатывая сырые экстракты горячей серной кислотой, в результате чего другие белки деградируют, а рибонуклеаза А остается неповрежденной. Определенные химические вещества вызывают протеолиз только после специфических остатков, и их можно использовать для селективного расщепления белка на более мелкие полипептиды для лабораторного анализа. Например, бромид циана расщепляет пептидную связь после метионина. Подобные методы могут быть использованы для специфического расщепления триптофанильных, аспартильных, цистеинильных и аспарагинильных пептидных связей. Для расщепления могут применяться кислоты, такие как трифторуксусная и муравьиная кислоты. Как и другие биомолекулы, белки также могут разрушаться только под воздействием высокой температуры. При 250 °C пептидная связь может быть легко гидролизована, а период полураспада сокращается примерно до минуты. Белок также может разрушаться без гидролиза посредством пиролиза; при деградации могут начинать образовываться небольшие гетероциклические соединения. Выше 500 °C могут образовываться полициклические ароматические углеводороды, что представляет интерес при изучении образования канцерогенов в табачном дыме и при приготовлении пищи при высоких температурах.