Пепсин: структура, функция и механизм действия

Введение

Энзим пепсин /'//p//ɛ//p//s//ɪ//n/ – это эндопептидаза, расщепляющая белки на более мелкие пептиды и аминокислоты. Он является одним из основных пищеварительных ферментов в пищеварительных системах человека и многих других животных, помогая переваривать белки, содержащиеся в пище. Пепсин относится к аспартическим протеазам и использует каталитический аспартат в активном центре. Предшественник пепсина (профермент), пепсиноген, выделяется главными клетками желудка в стенке желудка, а при смешивании с соляной кислотой желудочного сока пепсиноген активируется, превращаясь в пепсин.

История

Пепсин был одним из первых открытых ферментов, обнаруженных Теодором Шванном в 1836 году. Шванн дал ему название от греческого слова πέψις (pepsis), означающего «пищеварение» (от πέπτειν (peptein) – «переваривать»). Было установлено, что пепсин представляет собой кислотное вещество, способное превращать содержащие азот продукты питания в водорастворимые вещества. В 1928 году он стал одним из первых ферментов, которые были кристаллизованы, когда Джону Н. Нортропу удалось его кристаллизовать с помощью диализа, фильтрации и охлаждения.

Предшественник

Пепсин экспрессируется в виде зимогена, называемого пепсиногеном, первичная структура которого содержит на 44 аминокислоты больше, чем у активного фермента. В желудке пепсиноген выделяют главные клетки желудка. Этот зимоген активируется соляной кислотой (HCl), которая высвобождается париетальными клетками в слизистой оболочке желудка. Гормон гастрин и блуждающий нерв стимулируют выделение как пепсиногена, так и HCl из слизистой оболочки желудка при поступлении пищи. Соляная кислота создает кислую среду, которая позволяет пепсиногену разворачиваться и саморасщепляться автокаталитическим путем, тем самым образуя пепсин (активную форму). Пепсин отщепляет 44 аминокислоты от пепсиногена, создавая больше пепсина. Пепсиногены в основном подразделяются на 5 различных групп, основываясь на их первичной структуре: пепсиноген А (также называемый пепсиногеном I), пепсиноген B, прогастриксин (также называемый пепсиногеном II и пепсиногеном C), прохимозин (также называемый прореннином) и пепсиноген F (также называемый гликопротеином, связанным с беременностью).

Активность и стабильность

Пепсин наиболее активен в кислой среде при pH от 1,5 до 2,5. Соответственно, его основное место синтеза и активности – желудок (pH 1,5–2). У человека концентрация пепсина в желудке достигает 0,5–1 мг/мл. Пепсин неактивен при pH 6,5 и выше, однако он не полностью денатурируется или необратимо инактивируется до pH 8,0. Поэтому пепсин в растворах с pH до 8,0 может быть реактивирован при повторном подкислении. Стабильность пепсина при высоком pH имеет важное значение для заболеваний, связанных с ларингофарингеальным рефлюксом. Пепсин остается в гортани после эпизода гастроэзофагеального рефлюкса. При среднем pH ларингофаринкса (pH = 6,8) пепсин неактивен, но может быть реактивирован при последующих эпизодах кислотного рефлюкса, что приводит к повреждению местных тканей. Пепсин проявляет широкую специфичность расщепления. Он способен расщеплять до 20% поступивших амидных связей. Остатки в положениях P1 и P1' наиболее важны для определения вероятности расщепления. Как правило, гидрофобные аминокислоты в положениях P1 и P1' повышают вероятность расщепления. Фенилаланин, лейцин и метионин в положении P1, а также фенилаланин, триптофан и тирозин в положении P1' обеспечивают наибольшую вероятность расщепления. Пепсин остается в гортани (pH 6,8) после эпизода гастроэзофагеального рефлюкса. В некислотных условиях (при нейтральном pH) пепсин интернализируется клетками верхних дыхательных путей, таких как гортань и гипофаринкс, посредством процесса, известного как рецептор-опосредованный эндоцитоз. Рецептор, посредством которого осуществляется эндоцитоз пепсина, в настоящее время неизвестен. После попадания в клетку пепсин хранится во внутриклеточных везикулах с низким pH, при котором его ферментативная активность восстанавливается. Пепсин сохраняется в клетке до 24 часов. Такое воздействие пепсина при нейтральном pH и эндоцитоз пепсина вызывают изменения в экспрессии генов, связанные с воспалением, что является основой признаков и симптомов рефлюкса и прогрессирования опухоли. Данные и другие исследования связывают пепсин с канцерогенезом, обусловленным гастроэзофагеальным рефлюксом. Пепсин в образцах дыхательных путей считается чувствительным и специфичным маркером ларингофарингеального рефлюкса. Ведутся исследования по разработке новых терапевтических и диагностических средств, нацеленных на пепсин, для лечения гастроэзофагеального рефлюкса. В настоящее время доступен быстрый неинвазивный пепсин-диагностический тест под названием Peptest, который определяет наличие пепсина в образцах слюны.

Pepsin is most active in acidic environments between pH 1.5 to 2.5. Accordingly, its primary site of synthesis and activity is in the stomach (pH 1.5 to 2). In humans the concentration of pepsin in the stomach reaches 0.5 – 1 mg/mL. Pepsin is inactive at pH 6.5 and above, however pepsin is not fully denatured or irreversibly inactivated until pH 8.0. Therefore, pepsin in solutions of up to pH 8.0 can be reactivated upon re acidification. The stability of pepsin at high pH has significant implications on disease attributed to laryngopharyngeal reflux. Pepsin remains in the larynx following a gastric reflux event. At the mean pH of the laryngopharynx (pH = 6.8) pepsin would be inactive but could be reactivated upon subsequent acid reflux events resulting in damage to local tissues. Pepsin exhibits a broad cleavage specificity. Pepsin will digest up to 20% of ingested amide bonds. Residues in the P1 and P1' positions are most important in determining cleavage probability. Generally, hydrophobic amino acids at P1 and P1' positions increase cleavage probability. Phenylalanine, leucine and methionine at the P1 position, and phenylalanine, tryptophan and tyrosine at the P1' position result in the highest cleavage probability. Pepsin remains in the larynx (pH 6.8) following a gastric reflux event. Under non acid conditions (neutral pH), pepsin is internalized by cells of the upper airways such as the larynx and hypopharynx by a process known as receptor mediated endocytosis. The receptor by which pepsin is endocytosed is currently unknown. Upon cellular uptake, pepsin is stored in intracellular vesicles of low pH at which its enzymatic activity would be restored. Pepsin is retained within the cell for up to 24 hours. Such exposure to pepsin at neutral pH and endocyctosis of pepsin causes changes in gene expression associated with inflammation, which underlies signs and symptoms of reflux, and tumor progression. This and other research implicates pepsin in carcinogenesis attributed to gastric reflux. Pepsin in airway specimens is considered to be a sensitive and specific marker for laryngopharyngeal reflux. Research to develop new pepsin targeted therapeutic and diagnostic tools for gastric reflux is ongoing. A rapid non invasive pepsin diagnostic called Peptest is now available which determines the presence of pepsin in saliva samples.

Ингибиторы

Пепсин может быть ингибирован высоким pH (см. раздел «Активность и стабильность») или ингибирующими соединениями. Пепстатин – это соединение с низкой молекулярной массой, являющееся мощным и специфичным ингибитором кислотных протеаз, с константой ингибиторной диссоциации (Ki) около 10−10 М для пепсина. Считается, что статильный остаток пепстатина отвечает за ингибирование пепсина; статин является потенциальным аналогом переходного состояния для катализа пепсином и другими кислотными протеазами. Пепстатин не образует ковалентную связь с пепсином, поэтому ингибирование пепсина пепстатином является обратимым. 1-бис(диазоацетил)-2-фенилетан обратимо инактивирует пепсин при pH 5, реакция, которая ускоряется в присутствии Cu(II). Пепсин свиней ингибируется ингибитором пепсина 3 (PI 3), продуцируемым крупным круглым червем свиней (Ascaris suum). PI 3 занимает активный центр пепсина, используя свои N-концевые остатки, тем самым блокируя связывание субстрата. Аминокислотные остатки 1–3 (Gln Phe Leu) зрелого PI 3 связываются с положениями P1'–P3' пепсина. N-конец PI 3 в комплексе PI 3:пепсин позиционируется водородными связями, формирующими восьмицепочечный β-лист, где три цепи формируются пепсином, а пять – PI 3. Сукралфат, препарат, используемый для лечения язвы желудка и других состояний, связанных с пепсином, также ингибирует активность пепсина.

Приложения

Коммерческий пепсин извлекается из железистого слоя желудков свиней. Он является компонентом сычужного фермента, используемого для створаживания молока при производстве сыра. Пепсин применяется в пищевой промышленности для различных целей: для модификации и придания взбиваемости соевому белку и желатину, для модификации растительных белков для использования в безмолочных снеках, для превращения предварительно приготовленных злаков в быстрорастворимые каши, а также для получения гидролизатов животного и растительного белка, используемых в качестве ароматизаторов в пищевых продуктах и напитках. Он используется в кожевенной промышленности для удаления волос и остатков ткани со шкур, а также для извлечения серебра из отработанных фотоплёнок путем переваривания слоя желатина, удерживающего серебро. Пепсин исторически являлся добавкой в жевательную резинку марки Beeman, разработанную доктором Эдвином Э. Биманом. Пепсин обычно используется для получения фрагментов F(ab')2 из антител. В некоторых анализах предпочтительно использовать только антиген-связывающую (Fab) часть антитела. Для этих целей антитела могут быть ферментативно расщеплены для получения фрагмента Fab или фрагмента F(ab')2 антитела. Для получения фрагмента F(ab')2 IgG расщепляется пепсином, который разрывает тяжелые цепи вблизи шарнирного региона. Одна или несколько дисульфидных связей, соединяющих тяжелые цепи в шарнирном регионе, сохраняются, поэтому две Fab-области антитела остаются соединенными, образуя двухвалентную молекулу (содержащую два антиген-связывающих центра), отсюда и обозначение F(ab')2. Легкие цепи остаются неповрежденными и прикрепленными к тяжелой цепи. Fc-фрагмент расщепляется на мелкие пептиды. Fab-фрагменты образуются путем расщепления IgG папаином вместо пепсина. Папаин расщепляет IgG выше шарнирного региона, содержащего дисульфидные связи, соединяющие тяжелые цепи, но ниже места дисульфидной связи между легкой и тяжелой цепями. Это приводит к образованию двух отдельных моновалентных (содержащих один антиген-связывающий центр) Fab-фрагментов и неповрежденного Fc-фрагмента. Фрагменты могут быть очищены с помощью гель-фильтрации, ионного обмена или аффинной хроматографии. Fab- и F(ab')2-фрагменты антител используются в аналитических системах, где присутствие Fc-области может вызывать проблемы. В тканях, таких как лимфатические узлы или селезенка, или в препаратах периферической крови, присутствуют клетки с Fc-рецепторами (макрофаги, моноциты, B-лимфоциты и клетки-киллеры), которые могут связываться с Fc-областью неповрежденных антител, вызывая фоновое окрашивание в областях, не содержащих целевой антиген. Использование фрагментов F(ab')2 или Fab гарантирует, что антитела связываются с антигеном, а не с Fc-рецепторами. Эти фрагменты также могут быть предпочтительны для окрашивания клеточных препаратов в присутствии плазмы, поскольку они не способны связывать комплемент, который может лизировать клетки. F(ab')2 и, в большей степени, Fab-фрагменты обеспечивают более точную локализацию целевого антигена, например, при окрашивании тканей для электронной микроскопии. Дивалентность F(ab')2-фрагмента позволяет ему перекрестно связывать антигены, что позволяет использовать его в преципитационных анализах, для клеточной агрегации через поверхностные антигены или в розеточных анализах.

Commercial pepsin is extracted from the glandular layer of hog stomachs. It is a component of rennet used to curdle milk during the manufacture of cheese. Pepsin is used for a variety of applications in food manufacturing: to modify and provide whipping qualities to soy protein and gelatin, to modify vegetable proteins for use in nondairy snack items, to make precooked cereals into instant hot cereals, and to prepare animal and vegetable protein hydrolysates for use in flavoring foods and beverages. It is used in the leather industry to remove hair and residual tissue from hides and in the recovery of silver from discarded photographic films by digesting the gelatin layer that holds the silver. Pepsin was historically an additive of Beeman's gum brand chewing gum by Dr. Edwin E. Beeman. Pepsin is commonly used in the preparation of F(ab')2 fragments from antibodies. In some assays, it is preferable to use only the antigen binding (Fab) portion of the antibody. For these applications, antibodies may be enzymatically digested to produce either an Fab or an F(ab')2 fragment of the antibody. To produce an F(ab')2 fragment, IgG is digested with pepsin, which cleaves the heavy chains near the hinge region. One or more of the disulfide bonds that join the heavy chains in the hinge region are preserved, so the two Fab regions of the antibody remain joined together, yielding a divalent molecule (containing two antibody binding sites), hence the designation F(ab')2. The light chains remain intact and attached to the heavy chain. The Fc fragment is digested into small peptides. Fab fragments are generated by cleavage of IgG with papain instead of pepsin. Papain cleaves IgG above the hinge region containing the disulfide bonds that join the heavy chains, but below the site of the disulfide bond between the light chain and heavy chain. This generates two separate monovalent (containing a single antibody binding site) Fab fragments and an intact Fc fragment. The fragments can be purified by gel filtration, ion exchange, or affinity chromatography. Fab and F(ab')2 antibody fragments are used in assay systems where the presence of the Fc region may cause problems. In tissues such as lymph nodes or spleen, or in peripheral blood preparations, cells with Fc receptors (macrophages, monocytes, B lymphocytes, and natural killer cells) are present which can bind the Fc region of intact antibodies, causing background staining in areas that do not contain the target antigen. Use of F(ab')2 or Fab fragments ensures that the antibodies are binding to the antigen and not Fc receptors. These fragments may also be desirable for staining cell preparations in the presence of plasma, because they are not able to bind complement, which could lyse the cells. F(ab')2, and to a greater extent Fab, fragments allow more exact localization of the target antigen, i. e., in staining tissue for electron microscopy. The divalency of the F(ab')2 fragment enables it to cross link antigens, allowing use for precipitation assays, cellular aggregation via surface antigens, or rosetting assays.