Введение
Пищеварительный фермент
Химотрипсин (, химотрипсины А и В, альфа-химар офта, авазим, химар, химотест, энзеон, кимар, химотраза, альфа-химар, альфа-химотрипсин А, альфа-химотрипсин) – это компонент пищеварительного фермента поджелудочного сока, действующий в двенадцатиперстной кишке, где он осуществляет протеолиз – расщепление белков и полипептидов. Химотрипсин преимущественно расщепляет пептидные амидные связи, в которых боковая цепь аминокислоты, расположенной N-терминально к расщепляемой амидной связи (позиция P1), представляет собой крупную гидрофобную аминокислоту (тирозин, триптофан и фенилаланин). Эти аминокислоты содержат ароматическое кольцо в своей боковой цепи, которое помещается в гидрофобный карман (позиция S1) фермента. Он активируется в присутствии трипсина. Гидрофобное и структурное соответствие между боковой цепью пептидного субстрата в позиции P1 и связывающей полостью фермента в позиции S1 определяет субстратную специфичность этого фермента. Химотрипсин также гидролизует другие амидные связи в пептидах с меньшей скоростью, особенно те, которые содержат лейцин в позиции P1. Структурно, он является архетипической структурой для своего суперсемейства – клана PA протеаз.
Активация
Химотрипсин синтезируется в поджелудочной железе. Его предшественник – химотрипсиноген. Трипсин активирует химотрипсиноген, расщепляя пептидные связи в позициях Arg15 – Ile16, и образует π-химотрипсин. В свою очередь, аминная группа (NH3+) остатка Ile16 взаимодействует с боковой цепью Asp194, формируя "оксианионное отверстие" и гидрофобный "карман S1". Более того, химотрипсин индуцирует собственную активацию, расщепляясь в позициях 14–15, 146–147 и 148–149, что приводит к образованию α-химотрипсина (который более активен и стабилен, чем π-химотрипсин). Результирующая молекула состоит из трех полипептидных цепей, соединенных дисульфидными связями.
Механизм действия и кинетика
In vivo, химотрипсин является протеолитическим ферментом (серин-протеаза), действующим в пищеварительных системах многих организмов. Он облегчает расщепление пептидных связей посредством реакции гидролиза, которая, несмотря на термодинамическую благоприятность, протекает крайне медленно в отсутствие катализатора. Основными субстратами химотрипсина являются пептидные связи, в которых аминокислотный N-терминал к связи представляет собой триптофан, тирозин, фенилаланин или лейцин. Как и многие протеазы, химотрипсин также гидролизует амидные связи in vitro, что позволило использовать аналоги субстратов, такие как N-ацетил-L-фенилаланин p-нитрофениламид, для ферментных анализов. Химотрипсин расщепляет пептидные связи, атакуя нереактивную карбонильную группу мощным нуклеофилом – остатком серина 195, расположенным в активном центре фермента, который на короткое время ковалентно связывается с субстратом, образуя промежуточное соединение фермент-субстрат. Вместе с гистидином 57 и аспартатом 102 этот остаток серина составляет каталитическую триаду активного центра. Эти выводы основаны на анализах ингибирования и изучении кинетики расщепления вышеупомянутого субстрата, используя тот факт, что промежуточное соединение фермент-субстрат, p-нитрофенолят, имеет желтый цвет, что позволяет измерять его концентрацию путем измерения поглощения света при 410 нм. Катализ гидролиза белкового субстрата химотрипсином (изображен красным) происходит в два этапа. Сначала нуклеофильность Ser 195 усиливается общей щелочной катализацией, при которой протон серингидроксильной группы переносится на имидазольный фрагмент His 57 во время его атаки на электронодефицитный карбонильный углерод основной цепи белкового субстрата (этап k1). Это происходит благодаря согласованному действию трех аминокислотных остатков в каталитической триаде. Накопление отрицательного заряда на образовавшемся тетраэдрическом промежуточном соединении стабилизируется в оксианионном кармане активного центра фермента путем образования двух водородных связей с соседними амидными водородами основной цепи. Имидазольный фрагмент His 57, образовавшийся на этапе k1, является общим кислотным катализатором реакции k1. Однако доказательства аналогичного кислотного катализа реакции k2 (Tet2) были опровергнуты; по-видимому, вода предоставляет протон уходящей аминогруппе. Разложение Tet1 (через k3) генерирует ацилированный фермент, который гидролизуется с участием His 57 в качестве общего основания (kH2O) с образованием тетраэдрического промежуточного продукта, который распадается с регенерацией серингидроксильной группы, а также белкового фрагмента с вновь образованным карбоксильным концом.
Медицинское применение
Химотрипсин использовался во время операций по удалению катаракты. Он продавался под торговой маркой Zolyse.