Введение

Семейство ферментов

Глутатион-S-трансферазы (GST), ранее известные как лигандины, представляют собой семейство эукариотических и прокариотических изоферментов метаболизма фазы II, наиболее известные своей способностью катализировать конъюгацию восстановленной формы глутатиона (GSH) с ксенобиотическими субстратами для целей детоксикации. Семейство GST состоит из трех суперсемейств: цитозольного, митохондриального и микросомального – также известных как белки MAPEG. Члены суперсемейства GST чрезвычайно разнообразны по аминокислотной последовательности, и значительная часть последовательностей, размещенных в публичных базах данных, имеет неизвестную функцию. GST катализируют конъюгацию GSH посредством сульфгидрильной группы с электрофильными центрами широкого спектра субстратов, чтобы повысить растворимость соединений в воде.

Классификация

Последовательность и структура белка являются важными дополнительными критериями классификации для трех суперсемейств GST (цитозольного, митохондриального и MAPEG): классы цитозольного суперсемейства GST демонстрируют более 40% гомологии последовательностей, в то время как классы других суперсемейств могут иметь менее 25%. Цитозольные GST подразделяются на 13 классов на основе их структуры: альфа, бета, дельта, эпсилон, зета, тета, мю, ню, пи, сигма, тау, фи и омега. Митохондриальные GST относятся к классу каппа. Суперсемейство микросомальных GST MAPEG состоит из подгрупп I–IV, между которыми аминокислотные последовательности имеют менее 20% идентичности. Человеческие цитозольные GST принадлежат к классам альфа, зета, тета, мю, пи, сигма и омега, а известно о существовании шести изоферментов, относящихся к классам I, II и IV суперсемейства MAPEG.

Эволюция

Экологический стресс, вызванный природными токсинами, способствовал подготовке дрозофил к воздействию ДДТ. В частности, функция ГСТ в этом процессе двойственна: связывать как субстрат в гидрофобном H-центре фермента, так и GSH в соседнем гидрофильном G-центре, которые вместе формируют активный центр фермента; и впоследствии активировать тиольную группу GSH, обеспечивая нуклеофильную атаку на субстрат. Оба субъединицы димера GST, независимо от того, являются ли они гетеро- или гомодимерными, содержат один сайт связывания несубстратного соединения, а также сайт связывания GSH. Однако в гетеродимерных комплексах ГСТ, таких как те, что образуются цитозольными классами mu и alpha, дополнительный сайт связывания ксенобиотиков с высокой аффинностью расположен в щели между двумя субъединицами, что может объяснять способность ферментов образовывать гетеродимеры. Соединения, на которые нацелены ГСТ, охватывают широкий спектр экологических или иных экзогенных токсинов, включая химиотерапевтические препараты и другие лекарства, пестициды, гербициды, канцерогены и разнообразные эпоксиды; действительно, ГСТ отвечают за конъюгацию β1 8,9-эпоксида, реакционноспособного промежуточного продукта, образующегося из афлатоксина B1, что является важным механизмом защиты от этого токсина у грызунов. Реакции детоксикации включают первые четыре этапа синтеза меркаптуриновой кислоты. Однако некоторые эндогенные соединения, например, билирубин, могут ингибировать активность ГСТ. У млекопитающих изоформы ГСТ имеют клеточно-специфическое распределение (например, α ГСТ в гепатоцитах и π ГСТ в желчных протоках печени человека). ГСТ играют роль в процессе биоактивации пролекарства клопидогрела.

Роль в клеточной сигнализации

Хотя ГСТ наиболее известны своей способностью конъюгировать ксенобиотики с ГСГ, тем самым детоксифицируя клеточную среду, они также способны связывать не субстратные лиганды, что имеет важное значение для клеточной сигнализации. Показано, что несколько изоферментов ГСТ из различных классов ингибируют функцию киназы, участвующей в MAPK-пути, регулирующем пролиферацию и гибель клеток, препятствуя киназе в выполнении ее роли в облегчении сигнального каскада. Цитозольный GSTP1-1, хорошо изученный изофермент семейства ГСТ млекопитающих, экспрессируется преимущественно в тканях сердца, легких и мозга; фактически, это наиболее распространенный ГСТ, экспрессируемый вне печени. Учитывая его переэкспрессию в большинстве линий опухолевых клеток человека и распространенность в опухолях, устойчивых к химиотерапии, предполагается, что GSTP1-1 играет роль в развитии рака и его потенциальной устойчивости к лекарственному лечению. Дополнительным подтверждением этому служит знание о том, что GSTP может избирательно ингибировать фосфорилирование C-Jun киназой JNK, предотвращая апоптоз. Связь между ингибированием GSTP проапоптотического JNK-пути и переэкспрессией изофермента в лекарственно-устойчивых опухолевых клетках может объяснять способность этих клеток избегать апоптоза, индуцированного препаратами, которые не являются субстратами для GSTP.

Клиническое значение

В дополнение к своей роли в развитии рака и устойчивости к химиотерапевтическим препаратам, GST участвуют в развитии различных заболеваний благодаря своей связи с ГСГ. Несмотря на ограниченность данных о влиянии полиморфизмов GST альфа-, мю-, пи- и тета-классов на предрасположенность к различным типам рака, многочисленные исследования связывают такие генотипические вариации с астмой, атеросклерозом, аллергией и другими воспалительными заболеваниями. Особенно гены GST Омега-класса (GSTO) ассоциированы с неврологическими заболеваниями, такими как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и боковой амиотрофический склероз; вновь, окислительный стресс считается основной причиной, а снижение экспрессии генов GSTO приводит к более раннему началу этих заболеваний.

Выпуск GST как показатель повреждения органов

Высокая внутриклеточная концентрация ГСТ в сочетании с их клеточно-специфическим распределением позволяет использовать их в качестве биомаркеров для локализации и мониторинга повреждений определенных типов клеток. Например, гепатоциты содержат высокий уровень альфа-ГСТ, и альфа-ГСТ в сыворотке крови является индикатором повреждения гепатоцитов при трансплантации, токсичности и вирусных инфекциях. Аналогично, у человека почечные проксимальные канальцы содержат высокие концентрации альфа-ГСТ, а дистальные канальцы – пи-ГСТ. Такое специфическое распределение позволяет использовать измерение ГСТ в моче для количественной оценки и локализации повреждений почечных канальцев при трансплантации, нефротоксичности и ишемическом повреждении. В доклинических исследованиях на грызунах было показано, что альфа-ГСТ в моче и сыворотке является чувствительным и специфичным индикатором некроза клеток проксимальных почечных канальцев и гепатоцитов соответственно.

GST-теги и GST-оттяжной анализ

GST может быть присоединен к интересующему белку для его очистки из раствора в процессе, известном как pull-down assay (анализ "вытягивания"). Это достигается путем вставки кодирующей последовательности ДНК GST рядом с последовательностью, кодирующей интересующий белок. Таким образом, после транскрипции и трансляции белок GST и интересующий белок будут экспрессироваться вместе в виде белка-слияния (химерного белка). Поскольку белок GST обладает высоким сродством к GSH, бусины, покрытые этим соединением, могут быть добавлены к смеси белков; в результате, интересующий белок, связанный с GST, прикрепляется к бусинам, что позволяет изолировать его от остальных белков в растворе. Бусины извлекают и промывают свободным GSH для отсоединения интересующего белка от бусин, в результате чего получается очищенный белок. Эта методика может быть использована для изучения прямых белок-белковых взаимодействий. Недостатком этого анализа является то, что интересующий белок связан с GST, что изменяет его нативное состояние. GST-тег часто используется для выделения и очистки белков, содержащих белок-слияние с GST. Тег состоит из 220 аминокислот (примерно 26 кДа), что, по сравнению с тегами, такими как Myc или FLAG, является довольно большим размером. Его можно присоединить либо к N-концу, либо к C-концу белка. Помимо функции тега для очистки, GST действует как шаперон для присоединенного белка, способствуя его правильному сворачиванию, а также предотвращая агрегацию в телах включения при экспрессии в бактериях. GST-тег может быть легко удален после очистки путем добавления тромбина, если между GST-тегом и интересующим белком (что обычно предусмотрено во многих коммерчески доступных плазмидах с GST-тегом) вставлен подходящий сайт расщепления.