Флавин-адениндинуклеотид: окислительно-восстановительный кофермент

Введение

Редокс-активный кофермент

В биохимии флавин-аденодиндинуклеотид (FAD) является редокс-активным коферментом, связанным с различными белками и участвующим в нескольких ферментативных реакциях метаболизма. Флавопротеин – это белок, содержащий флавиновую группу, которая может быть в форме FAD или флавинмононуклеотида (FMN). Известно множество флавопротеинов: компоненты сукцинатдегидрогеназного комплекса, α-кетоглутаратдегидрогеназы и компонент пируватдегидрогеназного комплекса. FAD может существовать в четырех окислительно-восстановительных состояниях: оксид флавина N(5), хинон, семихинон и гидрохинон. FAD преобразуется между этими состояниями, принимая или отдавая электроны. FAD в своей полностью окисленной форме, или в форме хинона, принимает два электрона и два протона, превращаясь в FADH2 (гидрохинонная форма). Семихинон (FADH·) может образовываться либо в результате восстановления FAD, либо окисления FADH2, принимая или отдавая, соответственно, один электрон и один протон. Однако некоторые белки генерируют и поддерживают суперокисленную форму флавинового кофактора – оксид флавина N(5).

История

Флавопротеины были впервые обнаружены в 1879 году при разделении компонентов коровьего молока. Изначально они назывались лактохромами из-за их происхождения из молока и жёлтого пигмента. В 1938 году Варбург и Кристиан, проведя аналогичные эксперименты, обнаружили, что FAD является кофактором D-аминокислотной оксидазы. Работа Варбурга по установлению связи между никотинамидом и переносом гидрид-ионов, а также открытие флавинов, подготовили почву для многих ученых в 1940-х и 1950-х годах, которые открыли огромное количество окислительно-восстановительной биохимии и объединили её в метаболические пути, такие как цикл лимонной кислоты и синтез АТФ.

Свойства

Флавин аденодиндинуклеотид состоит из двух частей: нуклеотида аденина (аденозинмонофосфат) и мононуклеотида флавина (ФМН), соединенных через свои фосфатные группы. Аденин связан с циклической рибозой по 1'-углероду, а фосфат – с рибозой по 5'-углероду, образуя нуклеотид аденина. Рибофлавин формируется посредством углерод-азотной (C-N) связи между изоаллоксазином и рибитолом. Затем фосфатная группа присоединяется к терминальному углероду рибозы, формируя ФМН. Поскольку связь между изоаллоксазином и рибитолом не считается гликозидной, флавинмононуклеотид не является истинным нуклеотидом. Это делает название динуклеотида вводящим в заблуждение; однако группа флавинмононуклеотидов по-прежнему очень близка к нуклеотиду по структуре и химическим свойствам. FAD может восстанавливаться до FADH2 путем добавления 2 H+ и 2 e−. FADH2 также может окисляться с потерей 1 H+ и 1 e−, образуя FADH. Форма FAD может быть восстановлена путем дальнейшей потери 1 H+ и 1 e−. Образование FAD также может происходить посредством восстановления и дегидратации оксида флавина N(5). В зависимости от степени окисления флавины приобретают определенные цвета в водном растворе: оксид флавина N(5) (суперокисленный) – желто-оранжевый, FAD (полностью окисленный) – желтый, FADH (полувосстановленный) – синий или красный в зависимости от pH, а полностью восстановленная форма – бесцветна. Изменение формы может существенно влиять на другие химические свойства. Например, FAD, полностью окисленная форма, подвержена нуклеофильной атаке, полностью восстановленная форма FADH2 обладает высокой поляризуемостью, а полувосстановленная форма нестабильна в водном растворе. FAD представляет собой систему ароматических колец, в то время как FADH2 – нет. Это означает, что FADH2 имеет значительно более высокую энергию, лишенную стабилизации за счет резонанса, обеспечиваемой ароматической структурой. FADH2 является носителем энергии, поскольку после окисления он восстанавливает ароматичность и высвобождает энергию, связанную с этой стабилизацией. Спектроскопические свойства FAD и его производных позволяют контролировать реакции с помощью УФ-видимой абсорбционной и флуоресцентной спектроскопии. Каждая форма FAD имеет характерные спектры поглощения, что облегчает наблюдение за изменениями в степени окисления. Флавины, как правило, обладают флуоресцентной активностью в несвязанном состоянии (белки, связанные с производными нуклеиновых кислот флавина, называются флавопротеинами). Это свойство можно использовать при изучении связывания белков, наблюдая потерю флуоресцентной активности при связывании. Следовательно, люди должны получать рибофлавин, также известный как витамин B2, из пищевых источников. Широкий спектр ионизации и модификации флавиновой части обусловлен системой изоаллоксазиновых колец и способностью флавопротеинов значительно изменять кинетические параметры флавинов при связывании, включая флавинаденодиндинуклеотид (FAD). Количество генов, кодирующих флавин-зависимые белки в геноме (флавопротеом), зависит от вида и может варьироваться от 0,1% до 3,5%, при этом у человека насчитывается 90 генов, кодирующих флавопротеины. Клеточные концентрации свободных или нековалентно связанных флавинов в различных линиях культивируемых клеток млекопитающих составили FAD (2,2–17,0 амоль/клетку) и FMN (0,46–3,4 амоль/клетку). FAD имеет более положительный потенциал восстановления, чем NAD+, и является очень сильным окислителем. Клетка использует это во многих энергетически затратных окислительных реакциях, таких как дегидрирование связи C-C до алкена. FAD-зависимые белки функционируют в широком спектре метаболических путей, включая транспорт электронов, восстановление ДНК, биосинтез нуклеотидов, бета-окисление жирных кислот, катаболизм аминокислот, а также синтез других кофакторов, таких как CoA, CoQ и гемовые группы. Одна из известных реакций является частью цикла лимонной кислоты (также известного как цикл ТСА или цикл Кребса): сукцинатдегидрогеназа (комплекс II в цепи транспорта электронов) требует ковалентно связанного FAD для катализа окисления сукцината до фумарата, сочетая это с восстановлением убихинона до убихинола посредством окислительного фосфорилирования. Некоторые редокс-флавопротеины нековалентно связываются с FAD, например, ацетил-КоА-дегидрогеназы, участвующие в бета-окислении жирных кислот и катаболизме аминокислот, таких как лейцин (изовалерил-КоА-дегидрогеназа), изолейцин (дегидрогеназа короткоцепочечных/разветвленных ацил-КоА), валин (изобутирил-КоА-дегидрогеназа) и лизин (глутарил-КоА-дегидрогеназа). Дополнительные примеры FAD-зависимых ферментов, регулирующих метаболизм, включают глицерол-3-фосфатдегидрогеназу (синтез триглицеридов) и ксантиноксидазу, участвующую в катаболизме пуриновых нуклеотидов. Некаталитические функции, которые FAD может выполнять во флавопротеинах, включают структурные роли или участие в синечувствительных светочувствительных рецепторах, регулирующих биологические часы и развитие, а также генерацию света в биолюминесцентных бактериях. В геноме человека закодировано 90 флавопротеинов; около 84% требуют FAD, а около 16% – FMN, в то время как 5 белков требуют присутствия обоих.

Flavin adenine dinucleotide consists of two portions: the adenine nucleotide (adenosine monophosphate) and the flavin mononucleotide (FMN) bridged together through their phosphate groups. Adenine is bound to a cyclic ribose at the 1' carbon, while phosphate is bound to the ribose at the 5' carbon to form the adenine nucledotide. Riboflavin is formed by a carbon nitrogen (C N) bond between the isoalloxazine and the ribitol. The phosphate group is then bound to the terminal ribose carbon, forming a FMN. Because the bond between the isoalloxazine and the ribitol is not considered to be a glycosidic bond, the flavin mononucleotide is not truly a nucleotide. This makes the dinucleotide name misleading; however, the flavin mononucleotide group is still very close to a nucleotide in its structure and chemical properties. FAD can be reduced to FADH2 through the addition of 2 H+ and 2 e−. FADH2 can also be oxidized by the loss of 1 H+ and 1 e− to form FADH. The FAD form can be recreated through the further loss of 1 H+ and 1 e−. FAD formation can also occur through the reduction and dehydration of flavin N(5) oxide. Based on the oxidation state, flavins take specific colors when in aqueous solution. flavin N(5) oxide (superoxidized) is yellow orange, FAD (fully oxidized) is yellow, FADH (half reduced) is either blue or red based on the pH, and the fully reduced form is colorless. Changing the form can have a large impact on other chemical properties. For example, FAD, the fully oxidized form is subject to nucleophilic attack, the fully reduced form, FADH2 has high polarizability, while the half reduced form is unstable in aqueous solution. FAD is an aromatic ring system, whereas FADH2 is not. This means that FADH2 is significantly higher in energy, without the stabilization through resonance that the aromatic structure provides. FADH2 is an energy carrying molecule, because, once oxidized it regains aromaticity and releases the energy represented by this stabilization. The spectroscopic properties of FAD and its variants allows for reaction monitoring by use of UV VIS absorption and fluorescence spectroscopies. Each form of FAD has distinct absorbance spectra, making for easy observation of changes in oxidation state. Flavins in general have fluorescent activity when unbound (proteins bound to flavin nucleic acid derivatives are called flavoproteins). This property can be utilized when examining protein binding, observing loss of fluorescent activity when put into the bound state. Therefore, humans must obtain riboflavin, also known as vitamin B2, from dietary sources. This wide variety of ionization and modification of the flavin moiety can be attributed to the isoalloxazine ring system and the ability of flavoproteins to drastically perturb the kinetic parameters of flavins upon binding, including flavin adenine dinucleotide (FAD). The number of flavin dependent protein encoded genes in the genome (the flavoproteome) is species dependent and can range from 0.1% 3.5%, with humans having 90 flavoprotein encoded genes. FAD is the more complex and abundant form of flavin and is reported to bind to 75% of the total flavoproteome Cellular concentrations of free or non covalently bound flavins in a variety of cultured mammalian cell lines were reported for FAD (2.2 17.0 amol/cell) and FMN (0.46 3.4 amol/cell). FAD has a more positive reduction potential than NAD+ and is a very strong oxidizing agent. The cell utilizes this in many energetically difficult oxidation reactions such as dehydrogenation of a C C bond to an alkene. FAD dependent proteins function in a large variety of metabolic pathways including electron transport, DNA repair, nucleotide biosynthesis, beta oxidation of fatty acids, amino acid catabolism, as well as synthesis of other cofactors such as CoA, CoQ and heme groups. One well known reaction is part of the citric acid cycle (also known as the TCA or Krebs cycle); succinate dehydrogenase (complex II in the electron transport chain) requires covalently bound FAD to catalyze the oxidation of succinate to fumarate by coupling it with the reduction of ubiquinone to ubiquinol. by oxidative phosphorylation. Some redox flavoproteins non covalently bind to FAD like Acetyl CoA dehydrogenases which are involved in beta oxidation of fatty acids and catabolism of amino acids like leucine (isovaleryl CoA dehydrogenase), isoleucine, (short/branched chain acyl CoA dehydrogenase), valine (isobutyryl CoA dehydrogenase), and lysine (glutaryl CoA dehydrogenase). Additional examples of FAD dependent enzymes that regulate metabolism are glycerol 3 phosphate dehydrogenase (triglyceride synthesis) and xanthine oxidase involved in purine nucleotide catabolism. Noncatalytic functions that FAD can play in flavoproteins include as structural roles, or involved in blue sensitive light photoreceptors that regulate biological clocks and development, generation of light in bioluminescent bacteria. 90 flavoproteins are encoded in the human genome; about 84% require FAD, and around 16% require FMN, whereas 5 proteins require both to be present.

Углерод-кислород

Глюкозооксидаза (GOX) катализирует окисление β-D-глюкозы до D-глюконо-δ-лактона с одновременным восстановлением фермент-связанного флавина. GOX существует в виде гомодимера, при этом каждая субъединица связывает одну молекулу FAD. Кристаллические структуры показывают, что FAD связывается в глубоком кармане фермента вблизи димерного интерфейса. Исследования показали, что при замене FAD на 8-гидрокси-5-карбо-5-деазо-FAD стереохимия реакции определялась взаимодействием с re-стороной флавина. В процессе работы фермента наблюдаются нейтральные и анионные семихиноны, что указывает на радикальный механизм. P450-системы, расположенные в митохондриях, зависят от двух белков-переносчиков электронов: FAD-содержащей адренодоксинредуктазы (AR) и небольшого белка, содержащего железо-серную группу, называемого адренодоксином. FAD встроен в FAD-связывающий домен AR. FAD AR восстанавливается до FADH2 путем переноса двух электронов от NADPH, который связывается в NADP-связывающем домене AR. Структура этого фермента высоко консервативна для точного выравнивания донора электронов NADPH и акцептора FAD, обеспечивающего эффективный перенос электронов. Структуры редуктазы микросомальной и митохондриальной P450-систем полностью различны и не проявляют гомологии. Этот рынок, оцениваемый от 150 до 500 миллионов долларов, предназначен не только для медицинского применения, но также используется в качестве добавки к кормам для животных в сельскохозяйственной промышленности и в качестве пищевого красителя. Ученые уже определили две структуры, которые обычно принимает FAD при связывании: либо расширенную, либо конформацию «бабочки», при которой молекула, по сути, складывается пополам, что приводит к наложению аденинового и изоаллоксазинового колец. Имитаторы FAD, способные связываться аналогичным образом, но не позволяющие белку функционировать, могут быть полезными механизмами ингибирования бактериальной инфекции.

Оптогенетика

Оптогенетика позволяет контролировать биологические события неинвазивным способом. Эта область значительно продвинулась в последние годы благодаря ряду новых инструментов, включая те, которые позволяют вызывать светочувствительность, такие как домены FAD, использующие синий свет (BLUF). BLUF кодируют аминокислотную последовательность длиной от 100 до 140 аминокислот, происходящую из фоторецепторов растений и бактерий. Ученые используют это свойство для мониторинга прогрессирования заболеваний, оценки эффективности лечения или помощи в диагностике. Например, собственная флуоресценция FAD и NADH различается в нормальных тканях и при подслизистом фиброзе полости рта, что является ранним признаком инвазивного рака полости рта. Врачи, таким образом, применяют флуоресценцию для диагностики и контроля лечения, в отличие от стандартной биопсии.