Сигналы ядерной локализации: структура, функции и механизмы транспорта белков в ядро.

Введение

Сигнал или последовательность ядерной локализации (NLS) — это аминокислотная последовательность, которая «маркирует» белок для импорта в ядро клетки посредством ядерного транспорта. Обычно этот сигнал состоит из одной или нескольких коротких последовательностей положительно заряженных лизинов или аргининов, экспонированных на поверхности белка. NLS нуклеоплазмина, KR[PAATKKAGQA]KKKK, является прототипом широко распространенного двухкомпонентного сигнала: двух кластеров основных аминокислот, разделенных спейсером примерно из 10 аминокислот. Оба сигнала распознаются импортином α. Импортином α также содержит двухкомпонентный NLS, который специфически распознается импортином β. Последний можно рассматривать как фактический медиатор импорта. Chelsky и соавторы предложили консенсусную последовательность K K/R X K/R для однокомпонентных NLS. Rotello и соавторы сравнили эффективность ядерной локализации NLS, слитых с eGFP, для SV40 Large T Antigen, нуклеоплазмы (AVKRPAATKKAGQAKKKKLD), EGL 13 (MSRRRKANPTKLSENAKKLAKEVEN), c Myc (PAAKRVKLD) и TUS белка (KLKIKRPVK) с помощью быстрой внутриклеточной доставки белка. Они обнаружили значительно более высокую эффективность ядерной локализации NLS c Myc по сравнению с NLS SV40.

Неклассические

Существует множество других типов NLS, таких как кислый домен M9 hnRNP A1, последовательность KIPIK в репрессоре транскрипции дрожжей Matα2 и сложные сигналы U snRNP. Большинство из этих NLS, по-видимому, распознаются непосредственно специфическими рецепторами семейства импортина β без участия белка, подобного импортину α. Сигнал, специфичный для рибосомальных белков, производимых и транспортируемых в больших количествах, сопровождается специализированным набором ядерных импортных рецепторов, подобных импортину β. Недавно был предложен класс NLS, известных как PY NLS, впервые описанный Ли и соавторами. Этот мотив PY NLS, названный так из-за пар аминокислот пролин-тирозин в его составе, позволяет белку связываться с импортином β2 (также известным как транспортин или кариоферин β2), который затем транспортирует белок-груз в ядро. Структурная основа связывания PY NLS в импортине β2 была определена, и был разработан ингибитор импорта.

Открытие

Наличие ядерной мембраны, которая секвестрирует клеточную ДНК, является определяющей особенностью эукариотических клеток. Таким образом, ядерная мембрана отделяет ядерные процессы репликации ДНК и транскрипции РНК от цитоплазматического процесса производства белка. Белки, необходимые для ядра, должны быть направлены туда каким-то механизмом. Первое прямое экспериментальное исследование способности ядерных белков накапливаться в ядре было проведено Джоном Гурдоном, когда он показал, что очищенные ядерные белки накапливаются в ядре яйцеклеток лягушки (Xenopus) после микроинъекции в цитоплазму. Эти эксперименты были частью серии, которая впоследствии привела к исследованиям ядерного перепрограммирования, непосредственно относящимся к исследованиям стволовых клеток. Наличие нескольких миллионов пористых комплексов в ядерной мембране яйцеклетки и тот факт, что они, казалось, пропускают множество различных молекул (инсулин, альбумин сыворотки говядины, наночастицы золота), привели к мнению, что поры являются открытыми каналами, и ядерные белки свободно входят в ядро через поры и должны накапливаться путем связывания с ДНК или каким-либо другим ядерным компонентом. Другими словами, считалось, что не существует специфического транспортного механизма. Данное представление было опровергнуто Дингволом и Ласки в 1982 году. Используя белок под названием нуклеоплазмин, архетипичный «молекулярный шаперон», они идентифицировали домен в белке, который действует как сигнал для ядерного входа. Эта работа стимулировала исследования в этой области, и два года спустя первый NLS был идентифицирован в SV40 Large T антиген (или SV40, для краткости). Однако функциональный NLS не мог быть идентифицирован в другом ядерном белке только на основании сходства с SV40 NLS. Фактически, лишь небольшой процент клеточных (невирусных) ядерных белков содержал последовательность, подобную SV40 NLS. Детальное исследование нуклеоплазмина выявило последовательность с двумя элементами, состоящими из основных аминокислот, разделенных спейсером. Один из этих элементов был похож на SV40 NLS, но не мог направлять белок в ядро клетки при присоединении к неядерному белку-репортеру. Оба элемента необходимы. Этот тип NLS стал известен как двухкомпонентный классический NLS. Теперь известно, что двухкомпонентный NLS представляет собой основной класс NLS, обнаруженный в клеточных ядерных белках, и структурный анализ показал, как сигнал распознается рецепторным белком (импортином α) (структурная основа некоторых однокомпонентных NLS также известна). Многие молекулярные детали импорта ядерного белка теперь известны. Это стало возможным благодаря демонстрации того, что импорт ядерного белка является двухэтапным процессом: ядерный белок связывается с ядерным пористым комплексом в процессе, который не требует энергии. Затем следует энергозависимая транслокация ядерного белка через канал пористого комплекса. Установление наличия двух отдельных этапов в процессе позволило определить факторы, участвующие в нем, и привело к выявлению семейства рецепторов NLS – импортинов, и GTPase Ran.

The presence of the nuclear membrane that sequesters the cellular DNA is the defining feature of eukaryotic cells. The nuclear membrane, therefore, separates the nuclear processes of DNA replication and RNA transcription from the cytoplasmic process of protein production. Proteins required in the nucleus must be directed there by some mechanism. The first direct experimental examination of the ability of nuclear proteins to accumulate in the nucleus was carried out by John Gurdon when he showed that purified nuclear proteins accumulate in the nucleus of frog (Xenopus) oocytes after being micro injected into the cytoplasm. These experiments were part of a series that subsequently led to studies of nuclear reprogramming, directly relevant to stem cell research. The presence of several million pore complexes in the oocyte nuclear membrane and the fact that they appeared to admit many different molecules (insulin, bovine serum albumin, gold nanoparticles) led to the view that the pores are open channels and nuclear proteins freely enter the nucleus through the pore and must accumulate by binding to DNA or some other nuclear component. In other words, there was thought to be no specific transport mechanism. This view was shown to be incorrect by Dingwall and Laskey in 1982. Using a protein called nucleoplasmin, the archetypal ‘molecular chaperone’, they identified a domain in the protein that acts as a signal for nuclear entry. This work stimulated research in the area, and two years later the first NLS was identified in SV40 Large T antigen (or SV40, for short). However, a functional NLS could not be identified in another nuclear protein simply on the basis of similarity to the SV40 NLS. In fact, only a small percentage of cellular (non viral) nuclear proteins contained a sequence similar to the SV40 NLS. A detailed examination of nucleoplasmin identified a sequence with two elements made up of basic amino acids separated by a spacer arm. One of these elements was similar to the SV40 NLS but was not able to direct a protein to the cell nucleus when attached to a non nuclear reporter protein. Both elements are required. This kind of NLS has become known as a bipartite classical NLS. The bipartite NLS is now known to represent the major class of NLS found in cellular nuclear proteins and structural analysis has revealed how the signal is recognized by a receptor (importin α) protein (the structural basis of some monopartite NLSs is also known). Many of the molecular details of nuclear protein import are now known. This was made possible by the demonstration that nuclear protein import is a two step process; the nuclear protein binds to the nuclear pore complex in a process that does not require energy. This is followed by an energy dependent translocation of the nuclear protein through the channel of the pore complex. By establishing the presence of two distinct steps in the process the possibility of identifying the factors involved was established and led on to the identification of the importin family of NLS receptors and the GTPase Ran.

Механизм импорта ядерного топлива

Белок проникает в ядро через ядерную оболочку. Ядерная оболочка состоит из концентрических мембран – внешней и внутренней. Внутренняя и внешняя мембраны соединяются в нескольких точках, формируя каналы между цитоплазмой и нуклеоплазмой. Эти каналы заняты ядерными пористыми комплексами (ЯПК), сложными мультибелковыми структурами, которые обеспечивают транспорт через ядерную мембрану. Белок, транслированный с сигналом NLS, прочно связывается с импортином (также известным как кариоферин), и вместе этот комплекс перемещается через ядерную пору. В этот момент Ran-GTP связывается с комплексом импортина и белка, и это связывание приводит к снижению аффинности импортина к белку. Белок высвобождается, а комплекс Ran-GTP/импортин возвращается из ядра через ядерную пору. Активирующий белок GTPазы (GAP) в цитоплазме гидролизует Ran-GTP до GDP, что вызывает конформационное изменение в Ran и, в конечном итоге, снижает его аффинность к импортину. Импортин высвобождается, а Ran-GDP рециркулирует обратно в ядро, где фактор обмена гуаниннуклеотидов (GEF) обменивает GDP обратно на GTP.