Введение
Широко используемый фермент, получаемый из папайи
Папаин, также известный как папайя протеиназа I, — это цистеиновая протеаза, содержащаяся в папайе (Carica papaya) и горной папайе (Vasconcellea cundinamarcensis). Он является родоначальником семейства протеаз, подобных папаину. Обладает широким спектром коммерческого применения в кожевенной, косметической, текстильной, производстве моющих средств, пищевой и фармацевтической промышленности. В пищевой промышленности папаин используется как активный ингредиент во многих коммерческих средствах для размягчения мяса.
Семейство Папаин
Папаин относится к семейству родственных белков, известных как семейство протеаз, подобных папаину, обладающих широким спектром активности, включая эндопептидазы, аминопептидазы, дипептидилпептидазы и ферменты, проявляющие как экзо-, так и эндопептидазную активность. Представители семейства папаинов широко распространены и встречаются в бакуловирусах, эубактериях, дрожжах, а также практически во всех простейших, растениях и млекопитающих. Папаиноподобные цистеиновые протеиназы в основном синтезируются в виде неактивных проферментов (зимогенов) с N-концевыми пропептидными областями. Процесс активации этих ферментов включает удаление пропептидных областей, которые выполняют разнообразные функции in vivo и in vitro. Про-область необходима для правильного сворачивания вновь синтезированного фермента, инактивации пептидазного домена и стабилизации фермента против денатурации в нейтральных и щелочных условиях pH. Аминокислотные остатки в про-области опосредуют их взаимодействие с мембранами и играют роль в транспорте профермента в лизосомы. Одной из наиболее заметных особенностей пропептидов является их способность ингибировать активность соответствующих ферментов, а также то, что некоторые пропептиды демонстрируют высокую селективность в отношении ингибирования пептидаз, из которых они происходят.
Структура
Протеин-предшественник папаина содержит 345 аминокислотных остатков и состоит из сигнальной последовательности (1–18), пропептида (19–133) и зрелого пептида (134–345). Нумерация аминокислот приведена относительно зрелого пептида. Белок стабилизирован тремя дисульфидными мостиками. Его трехмерная структура состоит из двух различных структурных доменов, разделенных щелью. В этой щели находится активный центр, содержащий каталитическую диаду, которую сравнивают с каталитической триадой химотрипсина. Каталитическая диада образована аминокислотами цистеин 25 (благодаря которому определяется его классификация) и гистидин 159. Ранее считалось, что аспартат 158 играет роль, аналогичную роли аспартата в каталитической триаде серинпротеаз, но это впоследствии было опровергнуто.
Функция
Механизм, с помощью которого папаин разрушает пептидные связи, включает использование каталитической диады с депротонированным цистеином. Близлежащий Asn 175 помогает ориентировать имидазольное кольцо His 159, чтобы позволить ему депротонировать каталитический Cys 25. Затем цистеин осуществляет нуклеофильную атаку на карбонильный углерод пептидной цепи. Это образует ковалентный ацил-ферментный промежуточный продукт и освобождает аминотерминальную часть пептида. Фермент деацилируется молекулой воды и высвобождает карбокситерминальную часть пептида. В иммунологии известно, что папаин расщепляет Fc (кристаллизуемую) часть иммуноглобулинов (антител) от Fab (антигенсвязывающей) части. Папаин является относительно термостойким ферментом с оптимальным температурным диапазоном от 60 до 70 °C. Папаин предпочитает расщеплять пептидные связи после аргинина или лизина, которым предшествует гидрофобный остаток (Ala, Val, Leu, Ile, Phe, Trp, Tyr), и не за которым следует валин.
Применение
Папаин разрушает жесткие мышечные волокна и использовался еще до установления европейских контактов для размягчения мяса, употребляемого в его родной Южной Америке. Мясо в виде порошка с папаином в качестве активного компонента широко продается, а кулинарное использование кожуры папайи упоминается в научных публикациях. Папаин может использоваться для диссоциации клеток на первом этапе приготовления клеточных культур. Десятиминутная обработка небольших фрагментов ткани (объемом менее 1 мм³) позволит папаину начать расщеплять молекулы внеклеточного матрикса, удерживающие клетки вместе. По истечении десяти минут ткань следует обработать раствором ингибитора протеазы для прекращения протеолитической активности. Без обработки активность папаина приведет к полному лизису клеток. Затем ткань необходимо измельчить (быстро пропускать вверх и вниз через пипетку Пастера), чтобы разбить фрагменты ткани на одноклеточную суспензию. Он также используется в качестве ингредиента в различных ферментативных препаратах для дебридинга, в частности Accuzyme. Они применяются при лечении некоторых хронических ран для удаления омертвевшей ткани. Папаин добавляют в некоторые зубные пасты и мятные конфеты в качестве отбеливающего средства для зубов. Его отбеливающий эффект незначителен, поскольку папаин присутствует в низких концентрациях и быстро разбавляется слюной. Для достижения заметного эффекта потребуется несколько месяцев использования. Папаин является основным ингредиентом Papacarie, геля, используемого для химиомеханического удаления зубного кариеса. Он не требует сверления и не влияет на прочность адгезии реставрационных материалов к дентину. Известно, что папаин может искажать результаты анализа мочи на каннабиноиды. Он входит в состав некоторых препаратов для детоксикации. Недавно было показано, что папаин может быть использован для сборки тонких пленок диоксида титана, применяемых в фотоэлектрических элементах. Папаин также использовался для создания модели дегенеративного заболевания межпозвоночных дисков для оценки различных видов инъекционной терапии.
Иммуноглобулины
Антитело, расщепленное папаином, дает три фрагмента: два Fab-фрагмента массой 50 кДа и один Fc-фрагмент массой 50 кДа. Антитело, расщепленное папаином, не способно вызывать агглютинацию, осаждение, опсонизацию и лизис, однако Fab-фрагмент сохраняет способность связываться с соответствующими антигенами и нейтрализовать их, что наиболее часто наблюдается при использовании препаратов антител овец против кроталинового токсина, известных как CroFab, и Digibind – аналогичного фрагмента антисыворотки овец, применяемого для нейтрализации дигоксина, лекарственного средства для лечения сердечных заболеваний, при острой передозировке.
Производство
Папаин обычно производят в виде неочищенного, высушенного материала, собирая латекс из плодов дерева папайи. Латекс собирают после надреза шейки плода, где он может либо высыхать прямо на плоде, либо стекать в емкость. Затем этот латекс подвергают дальнейшей сушке. После этого он классифицируется как высушенный, неочищенный материал. Для удаления загрязняющих веществ необходима стадия очистки, которая включает растворение и экстракцию активной папаиновой ферментной системы посредством процесса, зарегистрированного государственными органами. Этот очищенный папаин может поставляться в виде порошка или жидкости.
Ограничения США на продажу
23 сентября 2008 года Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) предупредило компании о необходимости прекратить маркетинг глазных сбалансированных солевых растворов и местных лекарственных препаратов, содержащих папаин, до 4 ноября 2008 года. FDA заявило: "Лекарственные препараты, содержащие папаин для местного применения, исторически продавались без одобрения". Согласно заявлению FDA по данному вопросу, "эти неодобренные продукты подвергли риску здоровье потребителей: от сообщений о необратимой потере зрения при использовании неодобренных сбалансированных солевых растворов до резкого падения артериального давления и учащенного сердцебиения при применении местных препаратов с папаином", – заявила Джанет Вудкок, директор Центра оценки и исследований лекарственных средств.
Неодобренные местные папеиновые продукты
Местные лекарственные мази, содержащие папаин, используются для удаления мертвой или инфицированной ткани при острых и хронических поражениях, таких как диабетические язвы, пролежни, варикозные язвы и травматические инфицированные раны. Торговые названия этих препаратов включают Accuzyme, Allanfil, Allanzyme, Ethezyme, Gladase, Kovia, Panafil, Pap Urea и Ziox. Другие продукты продаются под названиями действующих веществ, например, мазь папаин-мочевина. В 2008 году FDA объявило о намерении принять меры в отношении этих продуктов, поскольку поступили сообщения о серьезных нежелательных реакциях у пациентов, использующих продукты, содержащие папаин. Сообщения включали реакции гиперчувствительности (аллергические реакции), приводящие к гипотензии (пониженному кровяному давлению) и тахикардии (учащенному сердцебиению). Кроме того, люди с аллергией на латекс также могут быть аллергичны к папайе, источнику папаина, что подразумевает повышенный риск развития нежелательной реакции на местный препарат, содержащий папаин, у людей с чувствительностью к латексу. FDA рекомендовало людям, испытывающим опасения по поводу использования местных препаратов папаина, проконсультироваться со своим лечащим врачом о прекращении их применения.