Репрезентационный анализ различий ДНК: принципы и применение
Representational difference analysis
Различия геномов: RDA, ROMA, MS RDA – методы выявления различий в ДНК и cDNA, включая метилирование. Субтрактивная гибридизация для биологических исследований.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Введение
Анализ репрезентативных различий (RDA) — это метод, используемый в биологических исследованиях для выявления различий в последовательностях двух геномных или кДНК образцов. Геномы или последовательности кДНК из двух образцов (например, ракового и нормального образца) амплифицируются методом ПЦР, а различия анализируются с помощью субтрактивной гибридизации ДНК. Эта технология была дополнительно усовершенствована благодаря разработке анализа олигонуклеотидных микромассивов репрезентативных различий (ROMA), который использует технологию микромассивов для проведения подобных анализов. Этот метод также может быть адаптирован для обнаружения различий в метилировании ДНК, как демонстрирует анализ репрезентативных различий, чувствительный к метилированию (MS RDA).
Representational difference analysis (RDA) is a technique used in biological research to find sequence differences in two genomic or cDNA samples. Genomes or cDNA sequences from two samples (i. e. cancer sample and a normal sample) are PCR amplified and differences analyzed using subtractive DNA hybridization. This technology has been further enhanced through the development of representation oligonucleotide microarray analysis (ROMA), which uses array technology to perform such analyses. This method may also be adapted to detect DNA methylation differences, as seen in methylation sensitive representational difference analysis (MS RDA).
Теория
Этот метод основан на ПЦР для дифференциальной амплификации негомологичных участков ДНК между фрагментами, полученными после расщепления двух почти идентичных видов ДНК, называемых "ДНК-диривером" и "ДНК-тестером". Обычно ДНК-тестер содержит интересующую последовательность, не гомологичную ДНК-дириверу. При смешивании двух видов последовательность ДНК-диривера добавляется в избытке к ДНК-тестеру. В ходе ПЦР двухцепочечные фрагменты сначала денатурируются при температуре около 95 °C, а затем повторно отжигаются при температуре отжига. Поскольку последовательности ДНК-диривера и ДНК-тестера почти идентичны, избыток фрагментов ДНК-диривера будет отжигаться с гомологичными фрагментами ДНК из ДНК-тестера. Это блокирует амплификацию ПЦР и не приводит к увеличению количества гомологичных фрагментов. Однако фрагменты, которые различаются между двумя видами, не будут отжигаться к комплементарному партнеру и будут амплифицированы с помощью ПЦР. По мере проведения большего числа циклов RDA пул копий уникальных фрагментов последовательности будет расти быстрее, чем фрагменты, присутствующие в обоих видах.
This method relies on PCR to differentially amplify non homologous DNA regions between digested fragments of two nearly identical DNA species, that are called 'driver' and 'tester' DNA. Typically, tester DNA contains a sequence of interest that is non homologous to driver DNA. When the two species are mixed, the driver sequence is added in excess to tester. During PCR, double stranded fragments first denature at ~95 °C and then re anneal when subjected to the annealing temperature. Since driver and tester sequences are nearly identical, the excess of driver DNA fragments will anneal to homologous DNA fragments from the tester species. This blocks PCR amplification and there is no increase in homologous fragments. However, fragments that are different between the two species will not anneal to a complementary counterpart and will be amplified by PCR. As more cycles of RDA are performed, the pool of unique sequence fragment copies will grow faster than fragments found in both species.