Введение
Класс ферментов
Энтеропептидаза (также называемая энтерокиназой) — это фермент, производимый клетками двенадцатиперстной кишки и участвующий в пищеварении у человека и других животных. Энтеропептидаза превращает трипсиноген (зимоген) в его активную форму — трипсин, что приводит к последующей активации панкреатических пищеварительных ферментов. Отсутствие энтеропептидазы приводит к нарушению переваривания пищи в кишечнике. Энтеропептидаза является серинпротеазой, состоящей из дисульфидно-связанной тяжелой цепи массой 82–140 кДа, которая закрепляет энтерокиназу в мембране ворсинок кишечника, и легкой цепи массой 35–62 кДа, содержащей каталитический субъединицу. Энтеропептидаза входит в клан химотрипсинов серинпротеаз и структурно сходна с этими белками.
Историческое значение
Энтеропептидаза была открыта Иваном Павловым, который был удостоен Нобелевской премии 1904 года по физиологии и медицине за исследования физиологии желудочно-кишечного тракта. Это первый известный фермент, активирующий другие ферменты, и он остается замечательным примером того, как сериновые протеазы были созданы для регуляции метаболических путей. Известно было, что пищеварительные ферменты в поджелудочной железе находятся в неактивном состоянии, в отличие от их высокой активности в кишечнике, но причина этого различия оставалась неизвестной. В 1899 году ученик Павлова, Н. П. Шеповальников, показал, что дуоденальный секрет собак значительно стимулирует пищеварительную активность ферментов поджелудочной железы, особенно трипсиногена. Активный принцип был определен как особый фермент в кишечнике, способный активировать другие ферменты. Павлов назвал его энтерокиназой. Споры о том, является ли энтерокиназа кофактором или ферментом, были разрешены Куницем, который продемонстрировал, что активация трипсиногена энтерокиназой носит каталитический характер. В 1950-х годах было показано, что трипсиноген крупного рогатого скота активируется автокаталитически путем расщепления N-концевого гексапептида. Более точное название, рекомендованное IUBMB – энтеропептидаза, используется с 1970 года. Однако оригинальное название «энтерокиназа» имеет долгую историю и до сих пор широко применяется.
Структура фермента
Энтеропептидаза является трансмембранной серинной протеазой (ТТСП) типа II, локализованной на границе щеточного края слизистой оболочки двенадцатиперстной и тощей кишки и синтезируемой в виде зимогена, проэнтеропептидазы, для активации которого необходим дуоденаз или трипсин. ТТСП синтезируются в виде одноцепочечных зимогенов с N-концевыми пропептидными последовательностями различной длины. Эти ферменты активируются путем расщепления карбоксильной стороны остатков лизина или аргинина, присутствующих в высококонсервативном мотиве активации. После активации, как предполагается, ТТСП остаются связанными с мембраной посредством консервативной дисульфидной связи, соединяющей про- и каталитические домены. В случае энтеропептидазы крупного рогатого скота первичный продукт трансляции состоит из 1035 аминокислотных остатков с ожидаемой массой 114,9 кДа. Обнаруженная кажущаяся масса около 160 кДа соответствует указанному содержанию углеводов в 30–40%, с равным количеством нейтральных и аминосахаров. Место активационного расщепления после Lys800 разделяет тяжелые и легкие цепи зрелой энтеропептидазы крупного рогатого скота. В тяжелой цепи имеется 17 потенциальных участков N-гликозилирования, а в легкой цепи – три; большинство из них консервативны у других видов. Тяжелая цепь содержит гидрофобный участок вблизи N-конца, который обеспечивает трансмембранный якорь. Тяжелая цепь влияет на специфичность энтеропептидазы. Нативная энтеропептидаза устойчива к ингибитору трипсина сои. Однако изолированная легкая цепь проявляет сниженную активность, независимо от того, получена ли она путем ограниченного восстановления природного белка или путем мутагенеза и экспрессии в клетках COS. Нативная энтеропептидаза и изолированная легкая цепь обладают сходной активностью в отношении Gly(Asp)4Lys NHNap, но активность изолированной легкой цепи в отношении трипсиногена заметно снижена. Аналогичный селективный дефект в распознавании трипсиногена может быть индуцирован в двухцепочечной энтеропептидазе путем нагревания или ацетилирования. Это указывает на то, что каталитический центр и один или несколько вторичных сайтов связывания субстрата необходимы для оптимального распознавания трипсиногена.
Генетика и болезненная значимость
У человека энтеропептидаза кодируется геном TMPRSS15 (также известным как ENTK, а ранее как PRSS7) на хромосоме 21q21. Некоторые нонсенс-мутации и мутации со сдвигом рамки считывания в этом гене приводят к редкому рецессивному заболеванию, характеризующемуся выраженным нарушением роста и развития у пораженных младенцев из-за дефицита энтеропептидазы. Экспрессия мРНК энтеропептидазы ограничена проксимальным отделом тонкой кишки, а белок обнаруживается в энтероцитах двенадцатиперстной кишки и проксимальной тощей кишки. После секреции из поджелудочной железы в двенадцатиперстную кишку трипсиноген взаимодействует с энтеропептидазой и активируется. Трипсин затем расщепляет и активирует другие панкреатические зимогены сериновых протеаз (химотрипсиноген и проэластазы), зимогены металлопротеаз (прокарбоксипептидазы) и пролипазы. Благодаря этой простой двухступенчатой каскаде, деструктивная активность этих пищеварительных гидролаз ограничивается просветом кишечника. Физиологическая важность этого пути подтверждается тяжелой кишечной мальабсорбцией, вызванной врожденным дефицитом энтеропептидазы. Это состояние может угрожать жизни, но поддается коррекции при пероральном приеме экстракта поджелудочной железы.
Приложения
Специфичность энтеропептидазы делает ее идеальным инструментом в биохимических приложениях; белок-слияние, содержащий C-концевой аффинный тег (например, поли His), соединенный этой последовательностью, может быть расщеплен энтеропептидазой для получения целевого белка после очистки белка.