Процессы производства и очистки антибиотиков

Введение

Производство антибиотиков – это естественный процесс, который, благодаря достижениям науки, теперь можно воспроизводить и улучшать в лабораторных условиях. Благодаря открытию пенициллина Александром Флемингом и работе Флори и Чейна в 1938 году, стало возможным крупномасштабное фармацевтическое производство антибиотиков. Подобно первоначальному открытию пенициллина, большинство антибиотиков было обнаружено случайно. Производство антибиотиков можно разделить на три метода: получение путем естественного брожения, полусинтетический и синтетический. Поскольку все больше бактерий приобретают устойчивость к существующим антибиотикам, исследования и разработка новых антибиотиков остаются важными. Помимо исследований и разработок в области производства новых антибиотиков, совершенствование систем доставки лекарств играет важную роль в повышении эффективности уже производимых антибиотиков. Достижения в этой области позволили добавлять антибиотики непосредственно в имплантируемые устройства, использовать аэрозолизацию антибиотиков для непосредственной доставки, а также комбинировать антибиотики с неантибиотическими препаратами для улучшения результатов лечения. Рост числа штаммов патогенных бактерий, устойчивых к антибиотикам, привел к острой необходимости финансирования исследований и разработок в этой области и стремлению к созданию новых, более эффективных антибиотиков.

Определение полезных антибиотиков

Несмотря на широкое разнообразие известных антибиотиков, менее 1% антимикробных агентов обладают медицинской или коммерческой ценностью. Например, в то время как пенициллин имеет высокий терапевтический индекс, поскольку обычно не оказывает влияния на клетки человека, это не относится ко многим другим антибиотикам. Другие антибиотики просто не имеют преимуществ перед уже используемыми, либо не имеют других практических применений. Полезные антибиотики часто обнаруживают с помощью скрининга. Для проведения такого скрининга культивируют изоляты множества различных микроорганизмов, а затем проверяют их на способность продуцировать диффундирующие вещества, подавляющие рост тестовых организмов. Большинство антибиотиков, выявленных в результате такого скрининга, уже известны и, следовательно, подлежат исключению. Остальные необходимо проверить на селективную токсичность и терапевтическую активность, а наиболее перспективные кандидаты могут быть изучены и, возможно, модифицированы. Более современным подходом является программа рационального дизайна. Она включает в себя скрининг, направленный на поиск новых природных соединений, ингибирующих конкретную мишень, например, фермент, встречающийся только у целевого патогена, а не тесты для общей оценки ингибирования роста культуры. Исследования в области идентификации антибиотиков показали возможность отказа от метода нанесения на чашку Петри сплошным посевом (lawn spotting), который повышает риск перекрестного загрязнения. Эта новая методология предполагает использование видов Lactobacillus и демонстрирует четкую зону ингибирования, а также позволяет определить минимальную подавляющую концентрацию.

Ферментация

Промышленная микробиология может использоваться для производства антибиотиков посредством процесса ферментации, при котором микроорганизм-источник выращивается в больших емкостях (100 000–150 000 литров и более), содержащих жидкую питательную среду. Концентрация кислорода, температура, pH и питательные вещества тщательно контролируются. Поскольку антибиотики являются вторичными метаболитами, численность популяции необходимо очень тщательно контролировать, чтобы обеспечить максимальный выход продукта до гибели клеток. По завершении процесса антибиотик необходимо извлечь и очистить до получения кристаллического продукта. Это проще сделать, если антибиотик растворим в органическом растворителе. В противном случае его сначала необходимо удалить с помощью ионного обмена, адсорбции или химического осаждения.

Полусинтетические

В наше время распространенной формой производства антибиотиков является полусинтетическая. Полусинтетическое производство антибиотиков сочетает в себе естественное брожение и лабораторные работы для повышения эффективности антибиотика. Повышение эффективности может достигаться за счет улучшения свойств самого препарата, увеличения количества производимого антибиотика и повышения его активности. В зависимости от производимого препарата и конечного назначения антибиотика определяется, какие характеристики необходимо оптимизировать. Примером полусинтетического производства служит препарат ампициллин. Являясь бета-лактамным антибиотиком, подобным пенициллину, ампициллин был разработан путем добавления дополнительной аминогруппы (NH2) к R-группе пенициллина. Эта дополнительная аминогруппа расширяет спектр действия ампициллина по сравнению с пенициллином. Метициллин – еще одно производное пенициллина, открытое в конце 1950-х годов. Ключевое отличие между пенициллином и метициллином заключается в добавлении двух метоксигрупп к фенильной группе. Эти метоксигруппы позволяют использовать метициллин против бактерий, продуцирующих пенициллиназу, которые в противном случае были бы устойчивы к пенициллину.

Синтетические

Не все антибиотики производятся бактериями; некоторые создаются полностью синтетически в лаборатории. К ним относятся хинолоны, и налидиксиновая кислота часто считается первой из них, которую открыли. Как и открытие других антибиотиков до неё, обнаружение налидиксиновой кислоты приписывают случайности – оно произошло, когда Джордж Лешер пытался синтезировать хлорохин. Однако недавнее исследование истории возникновения хинолонов показало, что описание хинолонов появилось еще в 1949 году, а патенты на них были поданы примерно за 5 лет до открытия Лешера.

Прогресс

Пенициллин был первым из открытых антибиотиков. После его открытия возникла задача – извлечь сырой, природный пенициллин и разработать метод, позволяющий осуществлять масштабное производство клинически значимого антибиотика. На протяжении многих лет команда под руководством Флори и Чейна, работавшая в Оксфорде, успешно очистила, сконцентрировала и начала производить антибиотик. Научно-технический прогресс не всегда способствовал улучшению условий производства антибиотиков. С 1987 года не было открыто новых классов антибиотиков для промышленного производства и широкого применения. Однако новые достижения в области геномного секвенирования и технологий привели к улучшениям и новым открытиям в сфере производства антибиотиков. Геномная инженерия генов, отвечающих за синтез антибиотиков, уже продемонстрировала возможность увеличения производства различных антибиотиков.

Производство и способ доставки антибиотиков

Антибиотики не становятся полностью функциональными и пригодными для применения сразу после производства. Часто требуется внести изменения в антибиотики для достижения максимальной эффективности. Послепроизводственные модификации включают в себя аэрозолизацию антибиотиков, чтобы избежать ненужного повреждения бактерий в других частях тела и обеспечить их доставку непосредственно в легкие. Нозокомиальные инфекции могут приводить к серьезным осложнениям во время и после хирургических вмешательств или госпитализации в целом. Комбинируя хирургические имплантаты с антибиотиками, медицинские работники могут воздействовать на конкретные области высокого риска инфекции, не прибегая к использованию антибиотиков в дозировке для всего организма. Меропенем – это антибиотик, который вводится в организм посредством инъекций. В исходном состоянии меропенем представляет собой кристаллический антибиотик, поэтому перед инъекцией его необходимо смешать с раствором. В процессе этого меропенем смешивается с карбонатом натрия, затем разбавляется водой, после чего его можно вводить инъекционно. Аэрозолизация антибиотиков необходима, поскольку инфекции легких особенно сложны в лечении, что требует прямого воздействия на очаг инфекции. Антибиотики широкого спектра действия могут оказывать негативные побочные эффекты, подавляя при этом необходимые непатогенные бактерии, обитающие в микробиоме человека. Аэрозолизация позволяет обойти микробиом желудочно-кишечного тракта, доставляя антибиотик непосредственно в легкие. Этот процесс осуществляется после производства самого антибиотика. Рост устойчивости бактерий к антибиотикам повлиял на имплантацию медицинских устройств. В некоторых случаях простой стерильности имплантатов при введении в организм недостаточно, теперь они должны активно бороться с бактериальной инфекцией. Поэтому антибиотики добавляются на поверхность имплантируемых устройств в качестве дополнительного уровня защиты от угрозы инфекции. Остеомиелит – одна из таких инфекций, которая представляет собой уникальные трудности в лечении. Одним из новых подходов является создание антибиотических цементных гвоздей, которые можно вставлять в инфицированную кость. Впервые описанные Пейли и Герценбергом, антибиотические цементные гвозди выполняют двойную функцию: стабилизацию кости, подлежащей лечению, и профилактику послеоперационной инфекции. Антибиотические цементные гвозди вводятся во время операции и изготавливаются непосредственно во время процедуры из материалов, доступных в операционной. Антибиотики смешиваются с цементной смесью, а затем формуются вокруг опорного якоря, часто используются грудные дренажи для обеспечения правильной формы. Грудные дренажи обладают преимуществом дешевизны и широкой доступности, а также показали свою эффективность в обеспечении однородности при производстве антибиотико-цементных гвоздей. Антибиотики заполняют пустоты в цементной матрице, и после высыхания и затвердевания их можно вставить в кость. Антибиотик имеет прямой контакт с очагом инфекции и сохраняет свои свойства при воздействии на него. Помимо цементных гвоздей, для лечения и профилактики остеомиелита, и в течение более длительного периода времени, используются антибиотические цементные спейсеры. При производстве антибиотико-цементного материала необходимо выбирать антибиотики, которые будут эффективны в этой гибридной форме; было установлено, что антибиотики в порошкообразной форме широкого спектра действия наиболее эффективны. Существуют рекомендации относительно количества антибиотика, используемого при смешивании с цементом, но общеотраслевых руководящих принципов пока не установлено.

Antibiotics do not render themselves fully functional and deliverable simply by being produced. Often modifications must be made to the antibiotics so that maximum efficiency is attained. Post production modifications include making antibiotics aerosolized so as to bypass doing unnecessary damage to bacteria located in other parts of the body and instead going directly to the lungs. Nosocomial infections can lead to serious complications during and in the recovery following surgery or a hospital stay in general. By merging surgical implants with antibiotics, healthcare providers are able to strike at a specific high risk area of infection without having to use a body wide size dosage of antibiotics. Meropenem is an antibiotic that is delivered into the body via injection. When produced meropenem is a crystalline antibiotic, so it must be mixed in with solution before injection can occur. During this process meropenem is mixed with sodium carbonate, then diluted in water after which it can be injected. Aerosolization of antibiotics is necessary because infections of the lung are especially troublesome, which is why direct targeting of the infection is needed. Broad spectrum antibiotics can have detrimental side effects when their action is also taken against necessary non pathogenic bacteria residing in the human microbiome. Aerosolization is effective in bypassing the microbiome that exists in the gastrointestinal tract by directing the antibiotic directly to the lungs. This process is undertaken after the production of the antibiotic itself. The rise of antibiotic resistant bacteria has affected implantation of medical devices. In some cases it is no longer enough for devices to be sterile when they are implanted into an individual, now they must be proactive in fighting off bacterial infection. As such antibiotics are now being added into the surface of implanted devices as an added layer of defense against the threat of infection. One such infection is Osteomyelitis which can offer a unique challenges in treatment efforts, one novel approach has been the creation of antibiotic cement nails which can be inserted into the infected bone. First described by Paley and Herzenberg antibiotic cement nails have dual purpose, both of stabilization of the bone being treated, and prevention against post procedure infection. Antibiotic cement nails are inserted during surgery, and are produced around the time of procedure using materials available in the operating room setting. Antibiotics are mixed in with cement filling then molded around a support anchor, often chest tubes are used to ensure proper molding. Chest tubes have the advantage of being cheap and ubiquitous and have been shown to have uniformity in the production of antibiotic cement nails. The antibiotics fill the voids within the cement matrix, and upon drying and setting can be inserted into the bone. The antibiotic has a direct contact with the area of infection and retains its properties in acting upon the infection. In addition to cement nails, antibiotic cement spacers have been used to treat and prevent osteomyelitis, and for a longer period of time. In producing the antibiotic cement material it is necessary to choose antibiotics that will be effective in this hybrid form, it has been found that antibiotics in powder form that are broad spectrum are of best use. There are recommendations for the amount of antibiotic that is used when mixing in with the cement, but industry wide guidelines have not been established.

Вызовы

Разработка антибиотиков – сложная задача, в то время как многие лекарственные препараты были результатом совместных усилий и интенсивных исследований и разработок, антибиотики, по-видимому, открывались случайно. С 1987 года не было ни одного открытия или разработки нового класса антибиотиков. Это отчасти связано со специфичностью антибиотиков. Поскольку большинство из них производятся биосинтетически, для их производства необходим живой организм. Исторически это означало выращивание и изучение различных видов на предмет наличия антимикробной активности. Для этого требуется не только наличие культивируемого вида, но и адекватные условия для его роста, обеспечивающие производство антибиотиков, а также достижение пороговой концентрации антибиотика для наблюдения за его функцией. Еще одна причина недостатка новых антибиотиков – снижение рентабельности инвестиций и, как следствие, недостаток ресурсов, выделяемых частными фармацевтическими компаниями на исследования и разработки. Всемирная организация здравоохранения признала опасность антибиотикорезистентных бактерий и составила список "приоритетных патогенов", вызывающих наибольшую обеспокоенность. Это сделано в надежде стимулировать исследования и разработки для создания нового поколения антибиотиков. В Соединенных Штатах Управление по передовым биомедицинским исследованиям и разработкам (BARDA) стремится поддерживать работу промышленности по производству новых антибиотиков. Накопление неорганического фосфата может ограничивать биосинтетическое производство некоторых антибиотиков. Исследователи обнаружили, что использование агента, связывающего неорганический фосфат, позволяет секвестрировать фосфат и восстановить нормальный уровень производства антибиотиков, тем самым обеспечивая продолжение производства. Меропенем смешивается с карбонатом натрия после производства перед введением в организм. Последующий анализ этой смеси с помощью ядерного магнитного резонанса показал образование второй формы меропенема. Эта вторая форма содержит дополнительный диоксид углерода и существует наряду с чистой формой. Для обеспечения стабильности меропенема в правильной форме был разработан четырехэтапный процесс, включающий смешивание сырого продукта с основанием в воде, установление оптимального pH, обработку алканолами и последующую изоляцию чистой формы.

Development of antibiotics is difficult, whereas many drug discoveries have been a result of concerted effort and intensive research and development, antibiotics have seemingly been discovered by chance. Since 1987 there have been no discoveries or development of a new class of antibiotics. This is partly due to the finicky nature of antibiotics. As most are produced biosynthetically they require an organism to produce. Historically this has meant that different species are grown and observed for any antimicrobial activity. Not only does this require a culturable species to start off with, but the conditions the species are grown in must be adequate for production of antibiotics as well as having the number of antibiotics produced reach a density threshold so that their function can be observed. Another reason behind the lack of new antibiotic production is the diminishing amount of return on investment for antibiotics and thus the lack resources put into research and development by private pharmaceutical companies. The World Health Organization has recognized the danger of antibiotic resistance bacteria and has created a list of "priority pathogens" that are of the utmost concern. In doing so the hope is to stimulate R&D that can create a new generation of antibiotics. In the United States, the Biomedical Advanced Research and Development Authority (BARDA) aims to support the work of the industry to produce new antibiotics. The buildup of inorganic phosphate can limit the biosynthetic production of certain antibiotics, researchers found that by using an inorganic phosphate trapping agent, the phosphate would be sequestered away and antibiotic production would return to normal levels, thus allowing production to continue. Meropenem is mixed with sodium carbonate post production before being injected into the body, subsequent analysis of this mixture using Nuclear Magnetic Resonance has shown that a second form of Meropenem is produced. This second form has an additional carbon dioxide on it, and exists alongside the pure form. In order to ensure that Meropenem stays in the correct form a four step process was developed wherein the crude form is mixed together with a base in water, a proper pH is established, the product is treated with alkanols, and then the pure form is isolated.