Введение

Класс ферментов

Бета-лактамазы (β-лактамазы) – это ферменты, продуцируемые бактериями, которые обеспечивают множественную устойчивость к бета-лактамным антибиотикам, таким как пенициллины, цефалоспорины, цефамицины, монобактамы и карбапенемы (ертапенем), хотя карбапенемы относительно устойчивы к действию бета-лактамаз. Бета-лактамаза обеспечивает устойчивость к антибиотикам, разрушая их структуру. Все эти антибиотики имеют общий элемент в своей молекулярной структуре: четырехчленный цикл, известный как бета-лактамное кольцо (β-лактамное кольцо). Путем гидролиза фермент лактамаза разрывает β-лактамное кольцо, деактивируя антибактериальные свойства молекулы. Бета-лактамазы, продуцируемые грамотрицательными бактериями, обычно секретируются, особенно при наличии антибиотиков в окружающей среде.

Структура

Структура серин-β-лактамазы Streptomyces (SBLs) характеризуется альфа-бета-складкой, напоминающей структуру DD-транспептидазы, от которой, как считается, этот фермент и произошел. β-лактамные антибиотики связываются с DD-транспептидазами, ингибируя биосинтез бактериальной клеточной стенки. Серинные β-лактамазы объединяются в типы A, C и D на основе сходства последовательностей. Другой тип бета-лактамаз – металло-β-лактамазы ("тип B"). Металло-β-лактамазы (MBL) для своей каталитической активности нуждаются в наличии металлического иона или ионов (1 или 2 иона Zn2+) в активном центре. Структура Нью-Делийской металло-β-лактамазы 1 напоминает RNase Z, от которой, как предполагается, она и произошла.

Механизм действия

Два типа бета-лактамаз действуют, основываясь на двух основных механизмах раскрытия β-лактамного кольца.

Пенициллиназа

Пенициллиназа – это специфический тип β-лактамазы, проявляющий специфичность к пенициллинам, посредством гидролиза β-лактамового кольца. Молекулярные массы различных пенициллиназ обычно группируются в районе 50 килодальтон. Пенициллиназа была первой идентифицированной β-лактамазой. Она была впервые выделена Абрахамом и Чейном в 1940 году из *E. coli* (которые являются грамотрицательными бактериями) еще до начала клинического применения пенициллина, однако производство пенициллиназы быстро распространилось на бактерии, которые ранее либо не производили ее, либо производили крайне редко. Были разработаны β-лактамы, устойчивые к пенициллиназе, такие как метициллин, но в настоящее время наблюдается широкая устойчивость даже к ним.

Резистентность у грам-отрицательных бактерий

Среди грамотрицательных бактерий появление устойчивости к цефалоспоринам расширенного спектра вызывает серьезную обеспокоенность. Изначально она возникла у ограниченного числа видов бактерий (E. cloacae, C. freundii, S. marcescens и P. aeruginosa), способных мутировать и гиперпродуцировать свою хромосомную β-лактамазу класса C. Через несколько лет устойчивость появилась у бактериальных видов, не производящих ферменты AmpC естественным образом (K. pneumoniae, Salmonella spp., P. mirabilis) из-за продукции ESBL (бета-лактамаз расширенного спектра) типов TEM или SHV. Характерно, что такая устойчивость охватывала оксиминоцефалоспорины (например, цефтизоксим, цефотаксим, цефтриаксон и цефтазидим, а также оксиминомонобактам астреонам), но не 7α-метоксицефалоспорины (цефамицины, то есть цефокситин и цефотетан); подавлялась ингибиторами, такими как клавуланат, сульбактам или тазобактам, и не распространялась на карбапенемы и темоциллин. Хромосомно-опосредованные AmpC β-лактамазы представляют собой новую угрозу, поскольку они обуславливают устойчивость к 7α-метоксицефалоспоринам (цефамицинам), таким как цефокситин или цефотетан, но не ингибируются коммерчески доступными ингибиторами β-лактамаз и могут, при потере поринов внешней мембраны в штаммах, обеспечивать устойчивость к карбапенемам.

Бета-лактамаза расширенного спектра (ESBL)

Члены этого семейства обычно экспрессируют β-лактамазы (например, TEM 3, TEM 4 и SHV 2), которые обуславливают устойчивость к цефалоспоринам расширенного спектра. В середине 1980-х годов была обнаружена эта новая группа ферментов – бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL), (впервые обнаруженные в 1979 году). Распространенность бактерий, продуцирующих ESBL, постепенно возрастает в стационарах интенсивной терапии. Распространенность в общей популяции варьируется в разных странах, например, около 6% в Германии и Франции, 13% в Саудовской Аравии и 63% в Египте. ESBL – это бета-лактамазы, которые гидролизуют цефалоспорины расширенного спектра, содержащие оксимино-боковую цепь. К этим цефалоспоринам относятся цефотаксим, цефтриаксон и цефтазидим, а также оксиминомонобактам астреонам. Таким образом, ESBL обуславливают множественную устойчивость к этим антибиотикам и связанным с ними оксимино-бета-лактамам. Как правило, они происходят из генов TEM 1, TEM 2 или SHV 1 в результате мутаций, изменяющих конфигурацию аминокислот вблизи активного центра этих β-лактамаз. Более широкий спектр β-лактамных антибиотиков подвержен гидролизу под действием этих ферментов. В последнее время описано все большее количество ESBL, не принадлежащих к линиям TEM или SHV. ESBL часто кодируются плазмидами. Плазмиды, ответственные за продукцию ESBL, часто несут гены, кодирующие устойчивость к другим классам лекарственных средств (например, аминогликозидам). Следовательно, возможности применения антибиотиков при лечении организмов, продуцирующих ESBL, крайне ограничены. Карбапенемы являются препаратами выбора для лечения серьезных инфекций, вызванных организмами, продуцирующими ESBL, однако в последнее время сообщалось об изолятах, устойчивых к карбапенемам (преимущественно к эртапенему). Организмы, продуцирующие ESBL, могут казаться восприимчивыми к некоторым цефалоспоринам расширенного спектра. Однако лечение такими антибиотиками связано с высоким процентом неудач.

Бета-лактамазы TEM (класс А)

TEM 1 – наиболее часто встречающаяся бета-лактамаза в грамотрицательных бактериях. До 90% устойчивости к ампициллину у E. coli обусловлено продукцией TEM 1. Она также отвечает за растущее число случаев устойчивости к ампициллину и пенициллину, наблюдаемых у H. influenzae и N. gonorrhoeae. Хотя бета-лактамазы типа TEM чаще всего встречаются у E. coli и K. pneumoniae, они также с возрастающей частотой обнаруживаются и у других видов грамотрицательных бактерий. Аминокислотные замены, ответственные за фенотип бета-лактамаз расширенного спектра (ESBL), локализуются вокруг активного центра фермента и изменяют его конформацию, обеспечивая доступ к оксимино-бета-лактамным субстратам. Расширение активного центра для бета-лактамных субстратов обычно также повышает чувствительность фермента к ингибиторам β-лактамаз, таким как клавулановая кислота. Одиночные аминокислотные замены в позициях 104, 164, 238 и 240 приводят к развитию фенотипа ESBL, однако ESBL с наиболее широким спектром обычно содержат более одной аминокислотной замены. На основании различных комбинаций изменений на сегодняшний день описано 140 ферментов типа TEM. TEM 10, TEM 12 и TEM 26 – одни из наиболее распространенных в Соединенных Штатах. Название TEM происходит от имени афинского пациента (Темониера), от которого штамм был выделен в 1963 году.

Бета-лактамазы SHV (класс А)

SHV 1 имеет 68-процентное совпадение аминокислот с TEM 1 и схожую общую структуру. Бета-лактамаза SHV 1 наиболее часто обнаруживается у K. pneumoniae и является причиной до 20% плазмидно-опосредованной устойчивости к ампициллину у этого вида. ESBL этого семейства также характеризуются изменениями аминокислот в области активного центра, чаще всего в позициях 238 или 238 и 240. Известно более 60 вариантов SHV. SHV 5 и SHV 12 – одни из наиболее распространенных.

Бета-лактамазы CTX-M (класс А)

Эти ферменты были названы в связи с их большей активностью против цефотаксима, чем против других оксимино-бета-лактамных субстратов (например, цефтазидима, цефтриаксона или цефепима). Они возникают не в результате мутации, а представляют собой примеры приобретения плазмидами генов бета-лактамаз, обычно встречающихся на хромосоме видов Kluyvera – группы редко патогенных комменсальных организмов. Эти ферменты не имеют тесной связи с бета-лактамазами TEM или SHV, демонстрируя лишь около 40% идентичности с этими двумя часто выделяемыми бета-лактамазами. В настоящее время известно более 172 ферментов CTX-M. Несмотря на своё название, некоторые из них проявляют большую активность в отношении цефтазидима, чем цефотаксима. Они широко распространены среди видов Enterobacteriaceae, в основном E. coli и K. pneumoniae. Обнаруженные в 1980-х годах, они с начала 2000-х годов получили широкое распространение и в настоящее время являются преобладающим типом ESBL в мире. Они обычно объединяются в пять групп на основе гомологий последовательностей: CTX-M 1, CTX-M 2, CTX-M 8, CTX-M 9 и CTX-M 25. CTX-M 15 (принадлежащий к кластеру CTX-M 1) является наиболее распространенным геном CTX-M. Пример бета-лактамазы CTX-M 15, вместе с ISEcp1, был обнаружен в виде транспозона, встроившегося в хромосому Klebsiella pneumoniae ATCC BAA 2146. Аббревиатура расшифровывается как "Cefotaxime Munich".

Бета-лактамазы OXA (класс D)

Бета-лактамазы OXA долгое время считались менее распространенным, но также опосредованным плазмидами вариантом бета-лактамазы, способным гидролизовать оксациллин и родственные антистафилококковые пенициллины. Эти бета-лактамазы отличаются от ферментов TEM и SHV тем, что принадлежат к молекулярному классу D и функциональной группе 2d. Бета-лактамазы типа OXA обеспечивают устойчивость к ампициллину и цефалотину и характеризуются высокой гидролитической активностью в отношении оксациллина и клоксациллина, а также слабой чувствительностью к ингибированию клавулановой кислотой. Аминокислотные замены в ферментах OXA также могут приводить к фенотипу ESBL. В то время как большинство ESBL обнаружены у E. coli, K. pneumoniae и других Enterobacteriaceae, ESBL типа OXA в основном встречаются у P. aeruginosa. ESBL типа OXA преимущественно выделялись из изолятов Pseudomonas aeruginosa, полученных в Турции и Франции. Семейство бета-лактамаз OXA изначально было создано как фенотипическая, а не генотипическая группа для нескольких бета-лактамаз, обладающих специфическим профилем гидролиза. Поэтому гомология последовательностей среди некоторых членов этого семейства может составлять всего 20%. Однако недавние добавления в это семейство демонстрируют некоторую степень гомологии с одним или несколькими существующими членами семейства бета-лактамаз OXA. Некоторые из них обеспечивают устойчивость преимущественно к цефтазидиму, но OXA 17 проявляет большую устойчивость к цефотаксиму и цефепиму, чем к цефтазидиму.

Другие

Были описаны другие плазмидно-опосредованные ESBL, такие как бета-лактамазы PER, VEB, GES и IBC, но они встречаются редко и в основном обнаружены у P. aeruginosa и в ограниченном числе географических регионов. PER 1 обнаружена в изолятах из Турции, Франции и Италии; VEB 1 и VEB 2 – в штаммах из Юго-Восточной Азии; GES 1, GES 2 и IBC 2 – в изолятах из Южной Африки, Франции и Греции. PER 1 также часто встречается у мультирезистентных видов ацинетобактерий в Корее и Турции. Некоторые из этих ферментов также обнаруживаются в Enterobacteriaceae, в то время как другие редкие ESBL (такие как BES 1, IBC 1, SFO 1 и TLA 1) были найдены исключительно в Enterobacteriaceae.

Лечение

В то время как организмы, продуцирующие ESBL, ранее ассоциировались преимущественно с больницами и учреждениями по уходу, сейчас эти организмы все чаще обнаруживаются в сообществе. E. coli, положительные по CTX-M 15, являются причиной инфекций мочевыводящих путей, приобретаемых в сообществе в Великобритании, и обычно устойчивы ко всем пероральным β-лактамным антибиотикам, а также к хинолонам и сульфаниламидам. Варианты лечения могут включать нитрофурантоин, фосфомицин, мециллинам и хлорамфеникол. В крайних случаях могут также применяться инъекции эртапенема или гентамицина один раз в сутки.

Ингибиторно-резистентные β-лактамазы

Хотя β-лактамазы, устойчивые к ингибиторам, не являются ESBL, они часто обсуждаются вместе с ESBL, поскольку также являются производными классических ферментов типов TEM или SHV. Изначально эти ферменты получили обозначение IRT – TEM β-лактамаза, устойчивая к ингибиторам, однако впоследствии все они были переименованы с использованием числовых обозначений TEM. Существует по крайней мере 19 различных TEM β-лактамаз, устойчивых к ингибиторам. β-лактамазы TEM, устойчивые к ингибиторам, в основном обнаруживаются в клинических изолятах E. coli, а также в некоторых штаммах K. pneumoniae, Klebsiella oxytoca, P. mirabilis и Citrobacter freundii. Хотя варианты TEM, устойчивые к ингибиторам, устойчивы к ингибированию клавулановой кислотой и сульбактамом, что проявляется в клинической устойчивости к комбинациям бета-лактама и ингибитора β-лактамазы – амоксициллин/клавуланат (ко-амоксиклав), тикарициллин/клавуланат (ко-тикаклав) и ампициллин/сульбактам, они обычно остаются чувствительными к ингибированию тазобактамом и, следовательно, к комбинации пиперациллин/тазобактам, хотя случаи резистентности также описаны. Это уже не является преимущественно европейской проблемой, она часто встречается в северных регионах Америки и должна быть исследована при сложных инфекциях мочевыводящих путей. Микроорганизмы, продуцирующие β-лактамазы типа AmpC, часто объединяются в клинической практике под аббревиатурой "SPACE": Serratia, Pseudomonas или Proteus, Acinetobacter, Citrobacter и Enterobacter.

Карбапенэмазы

Карбапенемы хорошо известны своей стабильностью к AmpC β-лактамазам и β-лактамазам расширенного спектра. Карбапенемазы – это разнообразная группа β-лактамаз, активных не только против оксиминоцефалоспоринов и цефамицинов, но и против карбапенемов. Ацтреонам стабилен к металло-β-лактамазам, однако многие продуценты IMP и VIM проявляют устойчивость из-за других механизмов. Ранее считалось, что карбапенемазы происходят только из классов A, B и D, но была описана карбапенемаза класса C.

Карбапенэмазы типа IMP (метало-β-лактамазы) (класс В)

Карбапенемазы типа IMP, опосредованные плазмидами (IMP расшифровывается как активные по отношению к имипенему), 19 вариантов которых известно на данный момент, закрепились в Японии в 1990-х годах как среди энтеробактерий (Gram-отрицательных бактерий), так и у видов Pseudomonas и Acinetobacter. Ферменты IMP медленно распространились в другие страны Дальнего Востока, были зарегистрированы в Европе в 1997 году и обнаружены в Канаде и Бразилии.

VIM (металло-β-лактамаза, кодируемая интеграновыми интегранами Вероны) (класс В)

Второе растущее семейство карбапенемаз – семейство VIM – было впервые описано в Италии в 1999 году и в настоящее время включает 10 представителей, широко распространенных в Европе, Южной Америке и странах Дальнего Востока, а также обнаруженных в Соединенных Штатах. VIM-1 был обнаружен в P. aeruginosa в Италии в 1996 году; с тех пор VIM-2, в настоящее время преобладающий вариант, неоднократно выявлялся в Европе и на Дальнем Востоке; VIM-3 и VIM-4 являются минорными вариантами VIM-2 и VIM-1 соответственно. Разнообразие последовательностей аминокислот достигает 10% в семействе VIM, 15% в семействе IMP и 70% между семействами VIM и IMP. Тем не менее, ферменты обоих семейств сохраняют сходство. Оба связаны с интегранами, иногда локализованными в плазмидах. Оба гидролизуют все β-лактамы, за исключением монобактамов, и устойчивы к β-лактамным ингибиторам. Ферменты VIM – одни из наиболее широко распространенных металло-β-лактамаз (MBL), о чем свидетельствуют сообщения о более чем 40 вариантах VIM. Биохимические и биофизические исследования показали, что варианты VIM демонстрируют лишь незначительные изменения в кинетических параметрах, но существенные различия в тепловой стабильности и профилях ингибирования.

Оксациллиназные группы β-лактамаз (класс D)

Группа β-лактамаз OXA встречается преимущественно у видов Acinetobacter и подразделяется на два кластера. Карбапенемазы OXA гидролизуют карбапенемы очень медленно in vitro, а высокие значения ПМК, наблюдаемые у некоторых штаммов Acinetobacter (>64 мг/л), могут быть обусловлены вторичными механизмами резистентности. В клинических изолятах они иногда дополняются другими механизмами устойчивости, такими как снижение проницаемости или эффлюкс. Карбапенемазы OXA также, как правило, обладают сниженной гидролитической активностью в отношении пенициллинов и цефалоспоринов.

KPC (K. pneumoniae carbapenemase) (класс А)

Несколько ферментов класса А, наиболее известные из которых – плазмидные KPC-ферменты, также являются эффективными карбапенемазами. Известно десять вариантов, от KPC-2 до KPC-11, которые различаются одним или двумя аминокислотными замещениями (KPC-1 был повторно секвенирован в 2008 году и оказался на 100% гомологичным опубликованным последовательностям KPC-2). KPC-1 был обнаружен в Северной Каролине, KPC-2 – в Балтиморе, а KPC-3 – в Нью-Йорке. Они имеют лишь 45% гомологии с ферментами SME и NMC/IMI и, в отличие от них, могут кодироваться самотрансмиссивными плазмидами. Карбапенемаза KPC (Klebsiella pneumoniae) класса А является наиболее распространенной карбапенемазой в мире и была впервые выявлена в 1996 году в Северной Каролине, США. Публикация 2010 года показала, что энтеробактерии, продуцирующие KPC, становятся все более распространенными в Соединенных Штатах.

CMY (класс C)

Первая карбапенемаза класса С была описана в 2006 году и выделена из высоковирулентного штамма Enterobacter aerogenes. Она находится на плазмиде pYMG 1 и, следовательно, может передаваться другим бактериальным штаммам.

SME (ферменты Serratia marcescens), IMI (IMIpenem-гидролизующая β-лактамаза), NMC и CcrA

В целом, они имеют небольшое клиническое значение. CcrA (CfiA). Его ген встречается примерно в 1–3% изолятов B. fragilis, но меньшее их количество производит фермент, поскольку для экспрессии требуется соответствующая миграция транспозона. CcrA был известен еще до появления имипенема, и число продуцентов практически не увеличилось после его введения.

NDM-1 (Нью-Дели металло-β-лактамаза) (класс В)

Первоначально описанный в Нью-Дели в 2009 году, этот ген сейчас широко распространен у Escherichia coli и Klebsiella pneumoniae из Индии и Пакистана. С середины 2010 года бактерии, несущие NDM-1, были занесены в другие страны (включая Соединенные Штаты и Великобританию), вероятно, из-за большого числа путешествующих по миру туристов, которые могли заразиться штаммом из окружающей среды, поскольку штаммы, содержащие ген NDM-1, были обнаружены в образцах окружающей среды в Индии. NDM имеет несколько вариантов, обладающих различными свойствами. Ранее предполагалось, что расщепление пенициллина этим ферментом поможет в лечении аллергической реакции. Хотя он оказался неэффективен при остром анафилактическом шоке, были получены положительные результаты при крапивнице и болях в суставах, предположительно вызванных аллергией на пенициллин. Его применение предлагалось в педиатрической практике при выявлении аллергии на пенициллин после введения вакцины против полиомиелита, в которой пенициллин использовался в качестве консерванта. Однако у некоторых пациентов развилась аллергия на нейтрапен. Больница Олбани исключила его из своего перечня лекарственных средств в 1960 году, всего через два года после включения, ссылаясь на отсутствие спроса. Некоторые исследователи продолжали использовать его в экспериментах по устойчивости к пенициллину до 1972 года. В 1997 году компания 3M Pharmaceuticals добровольно изъяла его с американского рынка.

Обнаружение

Энзимную активность бета-лактамазы можно обнаружить с помощью нитроцефина, хромогенного цефалоспоринового субстрата, который изменяет цвет с желтого на красный при гидролизе, катализируемом бета-лактамазой. Выявление бактерий, продуцирующих бета-лактамазы расширенного спектра (ESBL), можно проводить методом дисковой диффузии. Для этого используются диски с цефподоксимом, цефтазидимом, астреонамом, цефотаксимом и/или цефтриаксоном.

Эволюция

Бета-лактамазы – древние бактериальные ферменты. Металло-β-лактамазы ("класс B") все структурно похожи на RNase Z и, вероятно, эволюционировали из него. Из трех подклассов B1, B2 и B3, B1 и B2, по теории, эволюционировали около одного миллиарда лет назад, в то время как B3, по-видимому, возник независимо, возможно, до дивергенции грамположительных и грамотрицательных эубактерий около двух миллиардов лет назад. PNGM 1 (Papua New Guinea Metallo β lactamase 1) обладает как металло-β-лактамазной (MBL) активностью, так и активностью tRNase Z, что позволяет предположить, что PNGM 1, как считается, эволюционировал из tRNase Z, а активность B3 MBL у PNGM 1 является побочной, и подкласс B3 MBL, как полагают, эволюционировал в результате активности PNGM 1. Подклассы B1 и B3 были дополнительно подразделены. Серин-бета-лактамазы (классы A, C и D), по-видимому, эволюционировали из DD-транспептидаз, которые являются пенициллин-связывающими белками, участвующими в биосинтезе клеточной стенки, и таким образом являются одной из основных мишеней бета-лактамных антибиотиков. Эти три класса демонстрируют неопределяемое сходство последовательностей друг с другом, но все же могут быть сопоставлены с использованием структурной гомологии. Группы A и D являются сестринскими таксонами, а группа C дивергировала до A и D. Эти ферменты на основе серина, как и бета-лактамазы группы B, имеют древнее происхождение и, по теории, эволюционировали около двух миллиардов лет назад. В частности, группа OXA (в классе D), по теории, эволюционировала на хромосомах и перешла в плазмиды как минимум дважды.

Этимология

"β" (бета) указывает на положение азота во втором углероде цикла. Лактам – это сочетание слов «лактон» (от латинского *lactis*, молоко, поскольку молочная кислота была впервые выделена из скисшего молока) и «амид». Суффикс «аза», обозначающий фермент, происходит от «диастазы» (от греческого *diastasis*, "разделение") – первого фермента, открытого в 1833 году Пейеном и Персозом.