Неконкурентное ингибирование ферментов: влияние ингибиторов на активность, отличие от конкурентного ингибирования, работы Майкла и Ментена, кинетика ферментов.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Ингибирование фермента
Enzyme inhibition
Неконкурентное ингибирование – это тип ингибирования фермента, при котором ингибитор снижает активность фермента и связывается с ферментом с одинаковой эффективностью, независимо от того, связан ли с ним уже субстрат или нет. Это отличается от конкурентного ингибирования, при котором в присутствии ингибитора снижается сродство фермента к субстрату. Ингибитор может связываться с ферментом как до, так и после связывания с субстратом, но если его сродство к ферменту в одном из состояний выше, то он называется смешанным ингибитором. Как и многие другие ученые того времени, Леонор Михаэлис и Мод Ментен изучали реакцию, используемую для изменения состава сахарозы и ее расщепления на два продукта – фруктозу и глюкозу. Адриан Браун и Виктор Анри заложили основу для открытий в области кинетики ферментов, с которыми связаны имена Михаэлиса и Ментен. Они обнаружили, что глюкоза может спонтанно изменять свою форму, явление, известное как мутаротация, хотя оба соединения находились в декстроротаторной форме. Неучет этого фактора стал одной из основных причин неудач экспериментов Анри. Используя инвертазу для катализа инверсии сахарозы, они могли отслеживать скорость реакции фермента с помощью поляриметрии; таким образом, было установлено, что неконкурентное ингибирование происходит в реакции инверсии сахарозы под действием инвертазы. Либо можно определить аллостерическое ингибирование как определение неконкурентного ингибирования.
Non competitive inhibition is a type of enzyme inhibition where the inhibitor reduces the activity of the enzyme and binds equally well to the enzyme whether or not it has already bound the substrate. This is unlike competitive inhibition, where binding affinity for the substrate in the enzyme is decreased in the presence of an inhibitor. The inhibitor may bind to the enzyme whether or not the substrate has already been bound, but if it has a higher affinity for binding the enzyme in one state or the other, it is called a mixed inhibitor. Like many other scientists of their time, Leonor Michaelis and Maud Menten worked on a reaction that was used to change the composition of sucrose and make it lyse into two products – fructose and glucose. Adrian Brown and Victor Henri laid the groundwork for the discoveries in enzyme kinetics that Michaelis and Menten are known for. Although, these are both in the dextrorotatory form, this is where they noted that glucose can change spontaneously, also known as mutarotation. Failing to take this into consideration was one of the main reasons Henri's experiments fell short. Using invertase to catalyze sucrose inversion, they could see how fast the enzyme was reacting by polarimetry; therefore, non competitive inhibition was found to occur in the reaction where sucrose was inverted with invertase. or state the definition of allosteric inhibition as the definition for non competitive inhibition.
Механизм
Неконкурентное ингибирование моделирует систему, в которой ингибитор и субстрат могут быть связаны с ферментом одновременно. Когда субстрат и ингибитор связаны, комплекс фермент-субстрат-ингибитор не может образовывать продукт и может быть преобразован только обратно в комплекс фермент-субстрат или комплекс фермент-ингибитор. Неконкурентное ингибирование отличается от смешанного ингибирования тем, что ингибитор имеет одинаковое сродство как к ферменту, так и к комплексу фермент-субстрат. Например, в ферментативных реакциях гликолиза накопление фосфоенола катализируется пируваткиназой с образованием пирувата. Аланин – аминокислота, синтезируемая из пирувата, также ингибирует фермент пируваткиназу в процессе гликолиза. Аланин является неконкурентным ингибитором, поэтому он связывается вдали от активного центра с субстратом, чтобы последний все же мог стать конечным продуктом. Другой пример неконкурентного ингибирования – ингибирование гексокиназы в мозге глюкозо-6-фосфатом. Углероды 2 и 4 в глюкозо-6-фосфате содержат гидроксильные группы, которые вместе с фосфатом у углерода 6 присоединяются к комплексу фермент-ингибитор. Субстрат и фермент различаются по комбинациям групп, к которым прикрепляется ингибитор. Способность глюкозо-6-фосфата связываться в разных местах одновременно делает его неконкурентным ингибитором. Наиболее распространенный механизм неконкурентного ингибирования включает обратимое связывание ингибитора с аллостерическим центром, но ингибитор может действовать и другими способами, включая прямое связывание с активным центром. Он отличается от конкурентного ингибирования тем, что связывание ингибитора не препятствует связыванию субстрата, и наоборот, а лишь временно предотвращает образование продукта. Этот тип ингибирования снижает максимальную скорость химической реакции, не изменяя видимого аффинитета связывания катализатора с субстратом (Km<sub>app</sub> – см. кинетику Михаэлиса-Ментен). При добавлении неконкурентного ингибитора V<sub>max</sub> изменяется, а Km остается неизменным. Согласно графику Линевейвера-Берка, V<sub>max</sub> уменьшается при добавлении неконкурентного ингибитора, что на графике проявляется в изменении как наклона, так и точки пересечения с осью Y. Основное различие между конкурентным и неконкурентным ингибированием заключается в том, что конкурентное ингибирование влияет на способность субстрата связываться, замещая его ингибитором, что снижает аффинность фермента к субстрату. При неконкурентном ингибировании ингибитор связывается с аллостерическим центром и препятствует проведению химической реакции комплексом фермент-субстрат. Это не влияет на Km (аффинность) фермента (к субстрату). Неконкурентное ингибирование отличается от неконкурентного (анти-конкурентного) ингибирования тем, что оно все же позволяет субстрату связываться с комплексом фермент-ингибитор и образовывать комплекс фермент-субстрат-ингибитор, чего не происходит при анти-конкурентном ингибировании, которое препятствует связыванию субстрата с ферментом-ингибитором посредством конформационных изменений при аллостерическом связывании.
Non competitive inhibition models a system where the inhibitor and the substrate may both be bound to the enzyme at any given time. When both the substrate and the inhibitor are bound, the enzyme substrate inhibitor complex cannot form product and can only be converted back to the enzyme substrate complex or the enzyme inhibitor complex. Non competitive inhibition is distinguished from general mixed inhibition in that the inhibitor has an equal affinity for the enzyme and the enzyme substrate complex. For example, in the enzyme catalyzed reactions of glycolysis, accumulation phosphoenol is catalyzed by pyruvate kinase into pyruvate. Alanine is an amino acid which is synthesized from pyruvate also inhibits the enzyme pyruvate kinase during glycolysis. Alanine is a non competitive inhibitor, therefore it binds away from the active site to the substrate in order for it to still be the final product. Another example of non competitive inhibition is given by glucose 6 phosphate inhibiting hexokinase in the brain. Carbons 2 and 4 on glucose 6 phosphate contain hydroxyl groups that attach along with the phosphate at carbon 6 to the enzyme inhibitor complex. The substrate and enzyme are different in their group combinations that an inhibitor attaches to. The ability of glucose 6 phosphate to bind at different places at the same time makes it a non competitive inhibitor. The most common mechanism of non competitive inhibition involves reversible binding of the inhibitor to an allosteric site, but it is possible for the inhibitor to operate via other means including direct binding to the active site. It differs from competitive inhibition in that the binding of the inhibitor does not prevent binding of substrate, and vice versa, but simply prevents product formation for a limited time. This type of inhibition reduces the maximum rate of a chemical reaction without changing the apparent binding affinity of the catalyst for the substrate (Kmapp – see Michaelis Menten kinetics). When a non competitive inhibitor is added the Vmax is changed, while the Km remains unchanged. According to the Lineweaver Burk plot the Vmax is reduced during the addition of a non competitive inhibitor, which is shown in the plot by a change in both the slope and y intercept when a non competitive inhibitor is added. The primary difference between competitive and non competitive is that competitive inhibition affects the substrate's ability to bind by binding an inhibitor in place of a substrate, which lowers the affinity of the enzyme for the substrate. In non competitive inhibition, the inhibitor binds to an allosteric site and prevents the enzyme substrate complex from performing a chemical reaction. This does not affect the Km (affinity) of the enzyme (for the substrate). Non competitive inhibition differs from uncompetitive inhibition in that it still allows the substrate to bind to the enzyme inhibitor complex and form an enzyme substrate inhibitor complex, this is not true in uncompetitive inhibition, it prevents the substrate from binding to the enzyme inhibitor through conformational change upon allosteric binding.
Пример: неконкурентные ингибиторы фермента CYP2C9
Неконкурентные ингибиторы фермента CYP2C9 включают нифедипин, траннилципромин, феноэтилизотиоцианат и 6-гидроксифлавон. Компьютерное моделирование докинга и анализ сконструированных мутантов указывают на то, что сайт неконкурентного связывания 6-гидроксифлавона соответствует описанному аллостерическому сайту связывания фермента CYP2C9.
Noncompetitive inhibitors of CYP2C9 enzyme include nifedipine, tranylcypromine, phenethyl isothiocyanate, and 6 hydroxyflavone. Computer docking simulation and constructed mutants substituted indicate that the noncompetitive binding site of 6 hydroxyflavone is the reported allosteric binding site of CYP2C9 enzyme.