Тестирование чувствительности к антибиотикам в медицине

Введение

Микробиологический тест, используемый в медицине

Испытание чувствительности к антибиотикам, или определение восприимчивости бактерий к антибиотикам, – это измерение чувствительности бактерий к антибиотикам. Оно проводится, поскольку бактерии могут проявлять устойчивость к некоторым антибиотикам. Результаты определения чувствительности позволяют врачу изменить выбор антибиотика с эмпирической терапии, когда антибиотик подбирается на основании клинических предположений о месте инфекции и наиболее вероятных возбудителях, на направленную терапию, при которой выбор антибиотика основан на знании конкретного микроорганизма и его чувствительности. Определение чувствительности обычно выполняется в медицинской лаборатории с использованием методов культивирования, при которых бактерии подвергаются воздействию антибиотиков, или генетических методов, позволяющих выявить наличие у бактерий генов, обуславливающих устойчивость. Методы культивирования часто включают измерение диаметра зон подавления роста бактерий вокруг бумажных дисков, содержащих антибиотики, на чашках Петри с агаровым питательным средом, равномерно засеянных бактериями. Минимальная подавляющая концентрация – наименьшая концентрация антибиотика, останавливающая рост бактерий – может быть оценена по размеру зоны подавления. Определение чувствительности к антибиотикам стало необходимым с момента открытия бета-лактамного антибиотика пенициллина. Первоначальные методы были фенотипическими и включали культивирование или серийные разведения. Etest, антибиотикосодержащая полоска, доступен с 1980-х годов, а генетические методы, такие как тестирование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), – с начала 2000-х годов. Ведутся исследования по совершенствованию существующих методов, направленные на повышение их скорости и точности, а также разработку новых методов тестирования, таких как микрофлюидика.

Применение

В клинической медицине антибиотики чаще всего назначаются на основании симптомов пациента и медицинских рекомендаций. Этот метод выбора антибиотиков называется эмпирической терапией. Это связано с тем, что Escherichia coli является наиболее вероятным возбудителем, и может быть чувствительна к данной комбинации антибиотиков. Исследование чувствительности к антибиотикам предоставляет информацию о том, какие антибиотики с большей вероятностью будут эффективны и, следовательно, должны использоваться для лечения инфекции. Это делается для оценки распространенности устойчивости к антибиотикам (например, у метициллин-резистентного Staphylococcus aureus) и может повлиять на разработку рекомендаций и меры общественного здравоохранения.

Руководство

Метод дисковой диффузии включает в себя выбор штамма бактерий, нанесение его на агаровую пластинку и наблюдение за ростом бактерий вблизи дисков, пропитанных антибиотиками. Этот метод также известен как метод Кирби-Бауэра, хотя используются и модифицированные варианты. Данный тип исследования классифицируется как тест диффузии. В методах серийных разведений в агаре и бульоне бактерии помещают в ряд небольших пробирок с различными концентрациями антибиотиков. Минимальная концентрация антибиотика, подавляющая рост, определяется как МПК. Примером может служить использование ПЦР для выявления гена mecA у бета-лактам-резистентного золотистого стафилококка. Однако, обнаружение генов резистентности не всегда совпадает с профилем резистентности, определяемым фенотипическими методами. Затем ионизированные частицы ускоряются, регистрируются спектральные пики, формируя профиль экспрессии, который позволяет дифференцировать отдельные штаммы бактерий при сравнении с эталонными профилями.

Отчетность

Бактерии обозначаются как чувствительные, устойчивые или имеющие промежуточную устойчивость к антибиотику на основе минимальной подавляющей концентрации (МПК), которая является самой низкой концентрацией антибиотика, останавливающей рост бактерий. МПК сравнивается со стандартными пороговыми значениями (так называемыми "точками разрыва") для данной бактерии и антибиотика. Точки разрыва для одного и того же организма и антибиотика могут различаться в зависимости от места инфекции: например, CLSI обычно определяет Streptococcus pneumoniae как чувствительный к внутривенному пенициллину при МПК ≤0,06 мкг/мл, промежуточный при МПК от 0,12 до 1 мкг/мл и устойчивый при МПК ≥2 мкг/мл, но для случаев менингита точки разрыва значительно ниже. Иногда обозначение антибиотика как устойчивого также основано на бактериальных характеристиках, связанных с известными механизмами устойчивости, таких как потенциал к продукции бета-лактамазы. Могут отмечаться специфические паттерны лекарственной устойчивости или множественной лекарственной устойчивости, например, наличие бета-лактамазы расширенного спектра. Результаты тестов на чувствительность к антимикробным препаратам, выполненных за определенный период времени, могут быть скомпилированы, обычно в виде таблицы, для создания антибиотикограммы. Антибиограммы помогают врачу выбрать оптимальную эмпирическую антимикробную терапию, основываясь на местных паттернах устойчивости, до получения результатов лабораторных исследований. Идеальная антибиотикотерапия основана на определении возбудителя и его чувствительности к антибиотикам. Эмпирическое лечение часто начинают до получения результатов лабораторных микробиологических исследований. Это может быть при распространенных или относительно незначительных инфекциях, руководствуясь клиническими рекомендациями (например, при пневмонии, приобретенной в обществе), или при серьезных инфекциях, таких как сепсис или бактериальный менингит, при которых задержка лечения сопряжена со значительными рисками, а также при других оппортунистических инфекциях. На выбор антибиотиков могут влиять и другие факторы, включая необходимость проникновения в очаг инфекции (например, абсцесс) или подозрение, что одна или несколько причин инфекции не были выявлены в образце. Традиционные методы обычно занимают от 12 до 48 часов, хотя в некоторых случаях это может занять до пяти дней. Дополнительные исследования направлены на устранение недостатков существующих методов тестирования. Помимо длительности получения результатов при фенотипических методах, они трудоемки, сложно транспортируемы и трудно применимы в условиях ограниченных ресурсов, а также существует риск перекрестного загрязнения. Исследуется количественная ПЦР для определения процента обнаруженных бактерий, несущих ген устойчивости. Также изучается полногеномное секвенирование изолированных бактерий, которое, вероятно, станет более доступным по мере снижения стоимости и увеличения скорости анализа. Дополнительные исследуемые методы включают микрофлюидику, которая использует небольшое количество жидкости и различные методы тестирования, такие как оптические, электрохимические и магнитные. Такие анализы не требуют большого количества жидкости, они быстрые и портативные. Исследовалось использование флуоресцентных красителей, включающих меченые белки, нацеленные на биомаркеры, последовательности нуклеиновых кислот, присутствующие в клетках и обнаруживаемые при устойчивости бактерии к антибиотику. Изолят бактерий фиксируется и затем растворяется. Затем изолированный материал подвергается воздействию флуоресцентного красителя, который будет люминесцировать при просмотре. Также изучаются возможности улучшения существующих платформ, включая совершенствование систем визуализации, способных быстрее определять МПК в фенотипических образцах, или использование биолюминесцентных ферментов, выявляющих рост бактерий, чтобы сделать изменения более заметными.

Bacteria are marked as sensitive, resistant, or having intermediate resistance to an antibiotic based on the minimum inhibitory concentration (MIC), which is the lowest concentration of the antibiotic that stops the growth of bacteria. The MIC is compared to standard threshold values (called "breakpoints") for a given bacterium and antibiotic. Breakpoints for the same organism and antibiotic may differ based on the site of infection: for example, the CLSI generally defines Streptococcus pneumoniae as sensitive to intravenous penicillin if MICs are ≤0.06 μg/ml, intermediate if MICs are 0.12 to 1 μg/ml, and resistant if MICs are ≥2 μg/ml, but for cases of meningitis, the breakpoints are considerably lower. Sometimes, whether an antibiotic is marked as resistant is also based on bacterial characteristics that are associated with known methods of resistance such as the potential for beta lactamase production. Specific patterns of drug resistance or multidrug resistance may be noted, such as the presence of an extended spectrum beta lactamase. The results of antimicrobial susceptibility tests performed during a given time period can be compiled, usually in the form of a table, to form an antibiogram. Antibiograms help the clinician to select the best empiric antimicrobial therapy based on the local resistance patterns until the laboratory test results are available.|alt=See caption.]] Ideal antibiotic therapy is based on determining the causal agent and its antibiotic sensitivity. Empiric treatment is often started before laboratory microbiological reports are available. This might be for common or relatively minor infections based on clinical guidelines (such as community acquired pneumonia), or for serious infections, such as sepsis or bacterial meningitis, in which delayed treatment carries substantial risks. and other opportunistic infections. Other considerations may influence the choice of antibiotics, including the need to penetrate through to an infected site (such as an abscess), or the suspicion that one or more causes of an infection were not detected in a sample. Traditional techniques typically take between 12 and 48 hours, although it can take up to five days. Additional research is focused at the shortcomings of current testing methods. As well as the duration it takes to report phenotypic methods, they are laborious, have difficult portability and are difficult to use in resource limited settings, and have a chance of cross contamination. Quantitative PCR, with the view of determining the percent of a detected bacteria that possesses a resistance gene, is being explored. Whole genome sequencing of isolated bacteria is also being explored, and likely to become more available as costs decrease and speed increases over time. Additional methods explored include microfluidics, which uses a small amount of fluid and a variety of testing methods, such as optical, electrochemical, and magnetic. Such assays do not require much fluid to be tested, are rapid and portable. The use of fluorescent dyes has been explored. These involve labelled proteins targeted at biomarkers, nucleic acid sequences present within cells that are found when the bacterium is resistant to an antibiotic. An isolate of bacteria is fixed in position and then dissolved. The isolate is then exposed to fluorescent dye, which will be luminescent when viewed. Improvements to existing platforms are also being explored, including improvements in imaging systems that are able to more rapidly identify the MIC in phenotypic samples; or the use of bioluminescent enzymes that reveal bacterial growth to make changes more easily visible.