Введение
Метод молекулярной биологии, используемый для обнаружения фрагментации ДНК Терминальная дезоксинуклеотидилотрансфераза dUTP (TUNEL) - это метод обнаружения фрагментации ДНК путем маркировки 3'-гидроксильных концов в двойных нитках ДНК, генерируемых во время апоптоза.
Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) is a method for detecting DNA fragmentation by labeling the 3′ hydroxyl termini in the double strand DNA breaks generated during apoptosis.
Метод
TUNEL - это метод обнаружения фрагментации апоптотической ДНК, широко используемый для идентификации и количественной оценки апоптотических клеток или для обнаружения чрезмерного разрушения ДНК в отдельных клетках. Для этого используется терминальная дезоксинуклеотидилотрансфераза (TdT), фермент, который катализирует присоединение дезоксинуклеотидов, помеченных фторхромом или другим маркером, к 3'-гидроксильным концам двойных нитей ДНК. Он также может помечать клетки, у которых повреждение ДНК происходит не в процессе апоптоза.
История
Флуорохромный анализ TUNEL, применимый для цитометрии потока, сочетающий обнаружение разрывов нити ДНК с учетом положения фазы клеточного цикла, был первоначально разработан Gorczyca et al. Одновременно Gavrieli et al. описали метод маркировки авидиновой пероксидазы, применимый для светопоглощающего микроскопа. С 1992 года ТУНЕЛ стал одним из основных методов обнаружения апоптотической запрограммированной гибели клеток. Однако в течение многих лет ведутся споры о его точности из-за проблем в первоначальном анализе, которые привели к тому, что некротические клетки были неправильно помечены как апоптотические. Впоследствии этот метод был значительно улучшен, и если он выполнен правильно, он должен выявлять только клетки на последней фазе апоптоза. Новые методы включают в себя dUTP, модифицированные флуорофорами или гаптенами, включая биотин или бром, которые могут быть обнаружены непосредственно в случае флуоресцентно модифицированного нуклеотида (т.е. флуоресцеин dUTP), или косвенно со стрептавидином или антителами, если используется биотин dUTP или BrdUTP соответственно. Наиболее чувствительным из них является метод, использующий инкорпорацию BrdUTP с помощью TdT, за которой следует иммуноцитохимическое обнаружение BrdU.