Введение
Метод репликации ДНК
Вложенная полимеразная цепная реакция (ВПР) — это модификация полимеразной цепной реакции, предназначенная для снижения неспецифического связывания в продуктах, возникающего из-за амплификации нежелательных сайтов связывания праймеров.
Полимеразная цепная реакция
Сама полимеразная цепная реакция – это процесс, используемый для амплификации образцов ДНК посредством ДНК-полимеразы, активируемой температурой. Полученные продукты могут быть использованы для секвенирования или анализа, и этот процесс является ключевым элементом многих генетических исследовательских лабораторий, а также применяется в ДНК-дактилоскопии для криминалистики и других случаев, связанных с генетикой человека. Традиционная ПЦР требует использования праймеров, комплементарных концам целевой ДНК. Количество продукта ПЦР увеличивается с ростом числа температурных циклов, которым подвергается реакция. Распространенной проблемой является связывание праймеров с неверными участками ДНК, что приводит к образованию нежелательных продуктов. Вероятность возникновения этой проблемы возрастает с увеличением числа циклов ПЦР.
Примеры
Вложенная полимеразная цепная реакция использует два набора праймеров, применяемых в двух последовательных прогонах полимеразной цепной реакции, при этом второй набор предназначен для амплификации вторичной мишени внутри продукта первой реакции. Это позволяет проводить амплификацию при небольшом количестве циклов в первом раунде, ограничивая образование неспецифических продуктов. Второй, вложенный набор праймеров должен амплифицировать только целевой продукт, полученный в первом раунде амплификации, и не усиливать неспецифические продукты. Это позволяет увеличить общее количество циклов, минимизируя при этом образование неспецифических продуктов. Данный метод полезен при работе с редкими шаблонами или при ПЦР с высоким фоновым сигналом.
Процессы
Целевая ДНК подвергается первому циклу полимеразной цепной реакции с первым набором праймеров, показанным зеленым цветом. Выбор альтернативных и схожих участков связывания праймеров приводит к образованию множества продуктов, среди которых только один содержит целевую последовательность. Продукт первой реакции используется в качестве матрицы для второго цикла с использованием второго набора праймеров, показанного красным цветом. Крайне маловероятно, что какой-либо из нежелательных продуктов ПЦР содержит участки связывания для обоих новых наборов праймеров, что обеспечивает минимальное загрязнение конечного продукта второй ПЦР нежелательными продуктами.