Генерация разнообразия адаптивного иммунитета: V(D)J рекомбинация

Введение

Процесс генерации разнообразия адаптивного иммунитета

V(D)J-рекомбинация (перестройка вариабельного–разнообразного–соединяющего участков) — это механизм соматической рекомбинации, который происходит только в развивающихся лимфоцитах на ранних стадиях созревания Т- и В-клеток. Она приводит к формированию высокоразнообразного репертуара антител/иммуноглобулинов и Т-клеточных рецепторов (TCR) в В-клетках и Т-клетках соответственно. Этот процесс является определяющей характеристикой адаптивной иммунной системы. V(D)J-рекомбинация у млекопитающих происходит в первичных лимфоидных органах (костном мозге для В-клеток и тимусе для Т-клеток) и почти случайным образом перестраивает вариабельные (V), соединяющие (J) и, в некоторых случаях, разнообразные (D) генные сегменты. В конечном итоге этот процесс приводит к образованию новых аминокислотных последовательностей в антигенсвязывающих областях иммуноглобулинов и TCR, что позволяет распознавать антигены практически всех патогенов, включая бактерии, вирусы, паразитов и гельминтов, а также "измененные собственные клетки", как это наблюдается при раке. Распознавание также может носить аллергический характер (например, к пыльце или другим аллергенам) или может соответствовать тканям организма и приводить к аутоиммунитету. В 1987 году Сусуму Тонегава был удостоен Нобелевской премии по физиологии или медицине «за открытие генетического принципа генерации разнообразия антител».

Тяжелая цепь

В развивающейся В-клетке первым событием рекомбинации является рекомбинация между одним D- и одним J-сегментом гена локуса тяжелой цепи. Любая ДНК между этими двумя сегментами удаляется. За этой рекомбинацией D-J следует присоединение одного V-сегмента гена из области выше по течению от вновь образовавшегося комплекса DJ, формируя перестроенный VDJ-сегмент гена. Все остальные сегменты генов между V- и D-сегментами теперь удалены из генома клетки. Генерируется первичный транскрипт (несплайсированная РНК), содержащий область VDJ тяжелой цепи, а также постоянные цепи mu и delta (Cμ и Cδ). (то есть первичный транскрипт содержит сегменты: V D J Cμ Cδ). Первичная РНК подвергается процессингу для добавления полиаденилового (полиА) хвоста после цепи Cμ и удаления последовательности между VDJ-сегментом и этим постоянным сегментом гена. Трансляция этой мРНК приводит к образованию белка тяжелой цепи IgM.

Легкая цепь

Каппа (κ) и ламбда (λ) цепи локусов легких цепей иммуноглобулинов перестраиваются очень похожим образом, за исключением того, что легкие цепи не содержат D-сегмент. Иными словами, первый этап рекомбинации для легких цепей заключается в соединении V- и J-цепей с образованием комплекса VJ перед присоединением гена постоянной цепи во время первичной транскрипции. Трансляция сплайсированной мРНК для каппа- или ламбда-цепей приводит к образованию белка легкой цепи Ig κ или Ig λ. Ассоциация тяжелой цепи Ig μ с одной из легких цепей приводит к формированию мембранной формы иммуноглобулина IgM, экспрессируемой на поверхности незрелых B-клеток.

Рецепторы Т-клеток

Во время развития тимоцитов цепи Т-клеточного рецептора (TCR) подвергаются практически той же последовательности упорядоченных рекомбинационных событий, что и описано для иммуноглобулинов. Рекомбинация D-J происходит первой в β-цепи TCR. Этот процесс может включать либо соединение сегмента гена Dβ1 с одним из шести сегментов Jβ1, либо соединение сегмента гена Dβ2 с одним из шести сегментов Jβ2. Известно, что в этом процессе участвуют несколько других ферментов, включая ДНК-зависимую протеинкиназу (DNA PK), рентгеновский репарационный кросс-комплементирующий белок 4 (XRCC4), ДНК-лигазу IV, не-гомологичный фактор соединения концов 1 (NHEJ1; также известный как Cernunnos или XRCC4-подобный фактор [XLF]), недавно открытый паралог XRCC4 и XLF (PAXX), а также ДНК-полимеразы λ и μ. Некоторые из участвующих ферментов специфичны для лимфоцитов (например, RAG, TdT), в то время как другие встречаются в других типах клеток и даже повсеместно (например, компоненты NHEJ). Для поддержания специфичности рекомбинации V(D)J рекомбиназа распознает и связывается с последовательностями рекомбинационных сигналов (RSS), фланкирующими переменные (V), диверсифицирующие (D) и соединяющие (J) сегменты генов. RSS состоят из трех элементов: гептамера из семи консервативных нуклеотидов, спейсерной области длиной 12 или 23 пары оснований и нонамера из девяти консервативных нуклеотидов. Хотя последовательность большинства RSS варьируется, консенсусные последовательности гептамера и нонамера составляют CACAGTG и ACAAAAACC соответственно; и хотя последовательность спейсерной области слабо консервативна, ее длина строго сохраняется. Длина спейсерной области соответствует примерно одному (12 пар оснований) или двум виткам (23 пары оснований) ДНК-спирали. В соответствии с так называемым правилом 12/23, сегменты генов, подлежащие рекомбинации, обычно соседствуют с RSS разной длины спейсера (то есть один имеет "12RSS", а другой – "23RSS"). Это важная особенность в регуляции V(D)J рекомбинации.

Процесс

V(D)J рекомбинация начинается, когда V(D)J рекомбиназа (через активность RAG1) связывает RSS, фланкирующий кодирующий генный сегмент (V, D или J) и создает одноцепочечный разрыв в ДНК между первым основанием RSS (непосредственно перед гептамером) и кодирующим сегментом. Это по существу энергетически нейтрально (не требует гидролиза АТФ) и приводит к образованию свободной 3'-гидроксильной группы и 5'-фосфатной группы на одной и той же цепи. Реактивная гидроксильная группа позиционируется рекомбиназой для атаки фосфодиэфирной связи противоположной цепи, формируя два конца ДНК: шпильку (цикл стебля) на кодирующем сегменте и тупой конец на сигнальном сегменте. Современная модель предполагает, что разрыв ДНК и образование шпильки происходят на обеих цепях одновременно (или почти одновременно) в комплексе, известном как рекомбинационный центр. Тупые сигнальные концы лигируются друг с другом, образуя кольцевую молекулу ДНК, содержащую все промежуточные последовательности между кодирующими сегментами, известную как сигнальный сустав (хотя и кольцевой по своей природе, его не следует путать с плазмидой). Хотя изначально считалось, что они теряются во время последовательных делений клеток, есть данные, свидетельствующие о том, что сигнальные суставы могут повторно встраиваться в геном и приводить к патологиям, активируя онкогены или нарушая функцию генов-супрессоров опухолей. Кодирующие концы подвергаются дальнейшей обработке перед лигированием, включающей несколько событий, которые в конечном итоге приводят к разнообразию соединений. Обработка начинается, когда ДНК-PK связывается с каждым сломанным концом ДНК и рекрутирует несколько других белков, включая Artemis, XRCC4, ДНК-лигазу IV, Cernunnos и несколько ДНК-полимераз. ДНК-PK образует комплекс, который приводит к его аутофосфорилированию, что активирует Artemis. Шпильки на кодирующих концах раскрываются под действием Artemis. Если они раскрываются по центру, образуется тупой конец ДНК; однако во многих случаях раскрытие происходит "не по центру", что приводит к тому, что на одной цепи остаются дополнительные основания (одноцепочечный вылет). Они известны как палиндромные (P) нуклеотиды из-за палиндромной природы последовательности, образующейся при разрешении вылета ферментами репарации ДНК. Процесс раскрытия шпилек Artemis является критическим этапом V(D)J рекомбинации и дефектен в мышиной модели тяжелого комбинированного иммунодефицита (SCID). Далее XRCC4, Cernunnos и ДНК-PK выравнивают концы ДНК и рекрутируют терминальную дезоксинуклеотидилтрансферазу (TdT), ДНК-полимеразу, не требующую матрицы, которая добавляет нешаблонные (N) нуклеотиды к кодирующему концу. Добавление в основном случайное, но TdT проявляет предпочтение к нуклеотидам G/C. Как и все известные ДНК-полимеразы, TdT добавляет нуклеотиды к одной цепи в направлении 5'–3'. Наконец, экзонуклеазы могут удалять основания с кодирующих концов (включая любые P или N нуклеотиды, которые могли образоваться). Затем ДНК-полимеразы λ и μ вставляют дополнительные нуклеотиды по мере необходимости, чтобы сделать два конца совместимыми для соединения. Это стохастический процесс, поэтому может произойти любая комбинация добавления P и N нуклеотидов и экзонуклеолитического удаления (или их отсутствие). Наконец, обработанные кодирующие концы лигируются вместе ДНК-лигазой IV. Все эти процессы обработки приводят к образованию паратопа, который обладает высокой вариабельностью, даже при рекомбинации одних и тех же генных сегментов. V(D)J рекомбинация позволяет генерировать иммуноглобулины и Т-клеточные рецепторы к антигенам, с которыми организм или его предки ранее не сталкивались, обеспечивая адаптивный иммунный ответ на новые патогены, которые развиваются или часто меняются (например, сезонный грипп). Однако важным ограничением этого процесса является то, что последовательность ДНК должна оставаться в открытой рамке считывания, чтобы поддерживать правильную последовательность аминокислот в конечном белковом продукте. Если полученная последовательность сдвинута по рамке, развитие клетки будет остановлено, и клетка не доживет до зрелости. Таким образом, V(D)J рекомбинация является очень затратным процессом, который должен (и строго) регулироваться и контролироваться.

V(D)J recombination begins when V(D)J recombinase (through the activity of RAG1) binds a RSS flanking a coding gene segment (V, D, or J) and creates a single strand nick in the DNA between the first base of the RSS (just before the heptamer) and the coding segment. This is essentially energetically neutral (no need for ATP hydrolysis) and results in the formation of a free 3' hydroxyl group and a 5' phosphate group on the same strand. The reactive hydroxyl group is positioned by the recombinase to attack the phosphodiester bond of opposite strand, forming two DNA ends: a hairpin (stem loop) on the coding segment and a blunt end on the signal segment. The current model is that DNA nicking and hairpin formation occurs on both strands simultaneously (or nearly so) in a complex known as a recombination center. The blunt signal ends are flush ligated together to form a circular piece of DNA containing all of the intervening sequences between the coding segments known as a signal joint (although circular in nature, this is not to be confused with a plasmid). While originally thought to be lost during successive cell divisions, there is evidence that signal joints may re enter the genome and lead to pathologies by activating oncogenes or interrupting tumor suppressor gene function(s)[Ref]. The coding ends are processed further prior to their ligation by several events that ultimately lead to junctional diversity. Processing begins when DNA PK binds to each broken DNA end and recruits several other proteins including Artemis, XRCC4, DNA ligase IV, Cernunnos, and several DNA polymerases. DNA PK forms a complex that leads to its autophosphorylation, resulting in activation of Artemis. The coding end hairpins are opened by the activity of Artemis. If they are opened at the center, a blunt DNA end will result; however in many cases, the opening is "off center" and results in extra bases remaining on one strand (an overhang). These are known as palindromic (P) nucleotides due to the palindromic nature of the sequence produced when DNA repair enzymes resolve the overhang. The process of hairpin opening by Artemis is a crucial step of V(D)J recombination and is defective in the severe combined immunodeficiency (scid) mouse model. Next, XRCC4, Cernunnos, and DNA PK align the DNA ends and recruit terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), a template independent DNA polymerase that adds non templated (N) nucleotides to the coding end. The addition is mostly random, but TdT does exhibit a preference for G/C nucleotides. As with all known DNA polymerases, the TdT adds nucleotides to one strand in a 5' to 3' direction. Lastly, exonucleases can remove bases from the coding ends (including any P or N nucleotides that may have formed). DNA polymerases λ and μ then insert additional nucleotides as needed to make the two ends compatible for joining. This is a stochastic process, therefore any combination of the addition of P and N nucleotides and exonucleolytic removal can occur (or none at all). Finally, the processed coding ends are ligated together by DNA ligase IV. All of these processing events result in a paratope that is highly variable, even when the same gene segments are recombined. V(D)J recombination allows for the generation of immunoglobulins and T cell receptors to antigens that neither the organism nor its ancestor(s) need to have previously encountered, allowing for an adaptive immune response to novel pathogens that develop or to those that frequently change (e. g., seasonal influenza). However, a major caveat to this process is that the DNA sequence must remain in frame in order to maintain the correct amino acid sequence in the final protein product. If the resulting sequence is out of frame, the development of the cell will be arrested, and the cell will not survive to maturity. V(D)J recombination is therefore a very costly process that must be (and is) strictly regulated and controlled.