Антитела и иммуноглобулины: структура, функции и классы.

Антитела (иммуноглобулины) – Y-образные белки, ключевой компонент иммунной системы. Распознают и нейтрализуют антигены (бактерии, вирусы), обеспечивая защиту организма.

24 мин чтения

100%

Источник: Antibody — Wikipedia

Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.

Содержание

Введение

Белки, составляющие основную часть иммунной системы организма

класс белков

Антитело (Ab) – секретируемая форма рецептора B-клеток; термин иммуноглобулин (Ig) может относиться как к мембранно-связанной, так и к секретируемой форме рецептора B-клеток, но в целом это один и тот же белок, поэтому эти термины часто используются как синонимы. Антитела – крупные Y-образные белки, принадлежащие к суперсемейству иммуноглобулинов, которые используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации антигенов, таких как бактерии и вирусы, включая вызывающие заболевания. Антитела могут распознавать антигены практически любого размера и с разнообразным химическим составом. Каждое антитело распознает один или несколько специфических антигенов. Антиген буквально означает «генератор антител», поскольку именно присутствие антигена стимулирует образование антиген-специфических антител. Каждый кончик «Y» антитела содержит паратоп, который специфически связывается с одним конкретным эпитопом на антигене, обеспечивая точное связывание двух молекул. С помощью этого механизма антитела могут эффективно «маркировать» микробы или инфицированные клетки для атаки другими частями иммунной системы или нейтрализовать их напрямую (например, блокируя часть вируса, необходимую для его проникновения). Чтобы иммунная система могла распознавать миллионы различных антигенов, антигенсвязывающие участки на обоих концах антитела представлены в столь же широком разнообразии. Остальная структура антитела относительно универсальна. У человека антитела представлены пятью классами, иногда называемыми изотипами: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM. Антитела IgG и IgA человека также подразделяются на отдельные подклассы (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; IgA1 и IgA2). Класс относится к функциям, запускаемым антителом (также известным как эффекторные функции), в дополнение к некоторым другим структурным особенностям. Антитела разных классов также различаются по месту их высвобождения в организме и стадии иммунного ответа. Важно отметить, что классы и подклассы антител могут быть общими для разных видов (по крайней мере, по названию), но их функции и распределение по организму могут отличаться. Например, мышиный IgG1 ближе к человеческому IgG2, чем к человеческому IgG1, с точки зрения его функции. Термин гуморальный иммунитет часто используется как синоним антительного ответа, описывающий функцию иммунной системы, существующую в жидкостях организма в виде растворимых белков, в отличие от клеточного иммунитета, который обычно описывает реакции Т-клеток (особенно цитотоксических Т-клеток). В целом, антитела считаются частью адаптивной иммунной системы, хотя эта классификация может быть сложной. Например, природные IgM, которые производятся B1-линейными клетками, обладающими свойствами, более схожими с клетками врожденного иммунитета, чем с адаптивным, относятся к антителам IgM, образующимся независимо от иммунного ответа и демонстрирующим полиреактивность – они распознают несколько различных (несвязанных) антигенов. Они могут взаимодействовать с системой комплемента на самых ранних стадиях иммунного ответа, способствуя удалению антигена и доставке образовавшихся иммунных комплексов в лимфатические узлы или селезенку для запуска иммунного ответа. Таким образом, в этом контексте функция антител больше напоминает функцию врожденного иммунитета, чем адаптивного. Тем не менее, в целом антитела рассматриваются как часть адаптивной иммунной системы, поскольку они демонстрируют исключительную специфичность (с некоторыми исключениями), производятся посредством генетических перестроек (а не кодируются непосредственно в зародышевой линии) и являются проявлением иммунологической памяти. В ходе иммунного ответа B-клетки могут прогрессивно дифференцироваться в клетки, секретирующие антитела (сами B-клетки не секретируют антитела; однако B-клетки экспрессируют B-клеточные рецепторы, мембранную форму антитела, на своей поверхности) или B-клетки памяти. Клетки, секретирующие антитела, включают плазмобласты и плазмоклетки, которые различаются главным образом степенью секреции антител, продолжительностью жизни, метаболическими адаптациями и поверхностными маркерами. Плазмобласты – быстро пролиферирующие, недолговечные клетки, образующиеся на ранних стадиях иммунного ответа (классически описываемые как возникающие внефолликулярно, а не из зародышевого центра), которые потенциально могут дифференцироваться в плазмоклетки. Литература иногда небрежна и часто описывает плазмобласты как просто недолговечные плазмоклетки – формально это неверно. Плазмоклетки, напротив, не делятся (они терминально дифференцированы) и полагаются на ниши выживания, состоящие из определенных типов клеток и цитокинов, чтобы сохраняться. Плазмоклетки будут секретировать огромное количество антител, независимо от присутствия или отсутствия их когнатного антигена, обеспечивая, чтобы уровень антител к данному антигену не опускался до 0, пока плазмоклетки остаются живыми. Скорость секреции антител, однако, может регулироваться, например, присутствием адъювантов, стимулирующих иммунный ответ, таких как лиганды TLR. Долгоживущие плазмоклетки могут жить потенциально всю жизнь организма. Классически ниши выживания, в которых находятся долгоживущие плазмоклетки, расположены в костном мозге, хотя нельзя предполагать, что любая плазмоклетка в костном мозге будет долгоживущей. Однако другие исследования показывают, что ниши выживания могут легко образовываться в слизистых тканях – хотя классы участвующих антител демонстрируют другую иерархию, чем в костном мозге. B-клетки также могут дифференцироваться в B-клетки памяти, которые могут сохраняться десятилетиями, подобно долгоживущим плазмоклеткам. Эти клетки могут быть быстро восстановлены во вторичном иммунном ответе, подвергаясь переключению классов, аффинному созреванию и дифференцируясь в клетки, секретирующие антитела. Антитела играют центральную роль в иммунной защите, вызванной большинством вакцин и инфекций (хотя другие компоненты иммунной системы, безусловно, участвуют, и для некоторых заболеваний они гораздо важнее антител в формировании иммунного ответа, например, опоясывающий лишай). Долгосрочная защита от инфекций, вызванных данным микробом – то есть способность микроба проникать в организм и начинать реплицироваться (не обязательно вызывать заболевание) – зависит от устойчивого производства больших количеств антител, что означает, что эффективные вакцины в идеале должны вызывать стойкий высокий уровень антител, что зависит от долгоживущих плазмоклеток. В то же время многие микробы, имеющие медицинское значение, способны мутировать, чтобы избежать антител, вызванных предыдущими инфекциями, и долгоживущие плазмоклетки не могут подвергаться аффинному созреванию или переключению классов. Это компенсируется B-клетками памяти: новые варианты микроба, которые все еще сохраняют структурные особенности ранее встречавшихся антигенов, могут вызывать ответ B-клеток памяти, которые адаптируются к этим изменениям. Предполагается, что долгоживущие плазмоклетки секретируют B-клеточные рецепторы с более высокой аффинностью, чем те, что находятся на поверхности B-клеток памяти, но результаты по этому вопросу не совсем однозначны.

An antibody (Ab) is the secreted form of a B cell receptor; the term immunoglobulin (Ig) can refer to either the membrane bound form or the secreted form of the B cell receptor, but they are, broadly speaking, the same protein, and so the terms are often treated as synonymous. Antibodies are large, Y shaped proteins belonging to the immunoglobulin superfamily which are used by the immune system to identify and neutralize antigens such as bacteria and viruses, including those that cause disease. Antibodies can recognize virtually any size antigen with diverse chemical compositions from molecules. Each antibody recognizes one or more specific antigens. Antigen literally means "antibody generator", as it is the presence of an antigen that drives the formation of an antigen specific antibody. Each tip of the "Y" of an antibody contains a paratope that specifically binds to one particular epitope on an antigen, allowing the two molecules to bind together with precision. Using this mechanism, antibodies can effectively "tag" a microbe or an infected cell for attack by other parts of the immune system, or can neutralize it directly (for example, by blocking a part of a virus that is essential for its invasion). To allow the immune system to recognize millions of different antigens, the antigen binding sites at both tips of the antibody come in an equally wide variety. The rest of the antibody structure is relatively generic. In humans, antibodies occur in five classes, sometimes called isotypes: IgA, IgD, IgE, IgG, and IgM. Human IgG and IgA antibodies are also divided into discrete subclasses (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; IgA1 and IgA2). The class refers to the functions triggered by the antibody (also known as effector functions), in addition to some other structural features. Antibodies from different classes also differ in where they are released in the body and at what stage of an immune response. Importantly, while classes and subclasses of antibodies may be shared between species (at least in name), their functions and distribution throughout the body may be different. For example, mouse IgG1 is closer to human IgG2 than human IgG1 in terms of its function. The term humoral immunity is often treated as synonymous with the antibody response, describing the function of the immune system that exists in the body's humors (fluids) in the form of soluble proteins, as distinct from cell mediated immunity, which generally describes the responses of T cells (especially cytotoxic T cells). In general, antibodies are considered part of the adaptive immune system, though this classification can become complicated. For example, natural IgM, which are made by B 1 lineage cells that have properties more similar to innate immune cells than adaptive, refers to IgM antibodies made independently of an immune response that demonstrate polyreactivity they recognize multiple distinct (unrelated) antigens. These can work with the complement system in the earliest phases of an immune response to help facilitate clearance of the offending antigen and delivery of the resulting immune complexes to the lymph nodes or spleen for initiation of an immune response. Hence in this capacity, the function of antibodies is more akin to that of innate immunity than adaptive. Nonetheless, in general antibodies are regarded as part of the adaptive immune system because they demonstrate exceptional specificity (with some exception), are produced through genetic rearrangements (rather than being encoded directly in germline), and are a manifestation of immunological memory. In the course of an immune response, B cells can progressively differentiate into antibody secreting cells (B cells themselves do not secrete antibody; B cells do, however, express B cell receptors, the membrane bound form of the antibody, on their surface) or memory B cells. Antibody secreting cells comprise plasmablasts and plasma cells, which differ mainly in the degree to which they secrete antibody, their lifespan, metabolic adaptations, and surface markers. Plasmablasts are rapidly proliferating, short lived cells produced in the early phases of the immune response (classically described as arising extrafollicularly rather than from the germinal center) which have the potential to differentiate further into plasma cells. The literature is sloppy at times and often describes plasmablasts as just short lived plasma cells formally this is incorrect. Plasma cells, in contrast, do not divide (they are terminally differentiated), and rely on survival niches comprising specific cell types and cytokines to persist. Plasma cells will secrete huge quantities of antibody regardless of whether or not their cognate antigen is present, ensuring that antibody levels to the antigen in question do not fall to 0, provided the plasma cell stays alive. The rate of antibody secretion, however, can be regulated, for example, by the presence of adjuvant molecules that stimulate the immune response such as TLR ligands. Long lived plasma cells can live for potentially the entire lifetime of the organism. Classically, the survival niches that house long lived plasma cells reside in the bone marrow, though it cannot be assumed that any given plasma cell in the bone marrow will be long lived. However, other work indicates that survival niches can readily be established within the mucosal tissues though the classes of antibodies involved show a different hierarchy from those in the bone marrow. B cells can also differentiate into memory B cells which can persist for decades similarly to long lived plasma cells. These cells can be rapidly recalled in a secondary immune response, undergoing class switching, affinity maturation, and differentiating into antibody secreting cells. Antibodies are central to the immune protection elicited by most vaccines and infections (although other components of the immune system certainly participate and for some diseases are considerably more important than antibodies in generating an immune response, e. g. herpes zoster). Durable protection from infections caused by a given microbe – that is, the ability of the microbe to enter the body and begin to replicate (not necessarily to cause disease) – depends on sustained production of large quantities of antibodies, meaning that effective vaccines ideally elicit persistent high levels of antibody, which relies on long lived plasma cells. At the same time, many microbes of medical importance have the ability to mutate to escape antibodies elicited by prior infections, and long lived plasma cells cannot undergo affinity maturation or class switching. This is compensated for through memory B cells: novel variants of a microbe that still retain structural features of previously encountered antigens can elicit memory B cell responses that adapt to those changes. It has been suggested that long lived plasma cells secrete B cell receptors with higher affinity than those on the surfaces of memory B cells, but findings are not entirely consistent on this point.

Место связывания антигена

Переменные домены также могут называться регионом FV. Это подрегион Fab, который связывается с антигеном. Более конкретно, каждый переменный домен содержит три гипервариантных региона – аминокислоты в этих регионах наиболее сильно различаются между антителами. При сворачивании белка эти регионы формируют три петли из β-цепей, расположенные близко друг к другу на поверхности антитела. Эти петли называются определяющими комплементарность регионами (CDR), поскольку их форма комплементарна форме антигена. Три CDR от каждой тяжелой и легкой цепи вместе образуют антигенсвязывающий сайт, форма которого может варьироваться от кармана для меньшего антигена до большей поверхности или выступа, входящего в углубление антигена. Однако, как правило, лишь несколько аминокислотных остатков вносят основной вклад в энергию связывания. Это было недавно показано Норт и др. и Николудис и др. Тем не менее, описание антигенсвязывающего сайта антитела, основанное только на одной статической структуре, ограничивает понимание и характеристику функции и свойств антитела. Для улучшения прогнозирования структуры антител и учета сильно скоррелированных движений петель CDR и интерфейса, паратопы антител следует описывать как взаимопревращающиеся состояния в растворе с различными вероятностями. В рамках теории иммунной сети CDR также называют идиотипами. Согласно теории иммунной сети, адаптивная иммунная система регулируется взаимодействием между идиотипами.

Комплексы антител

Выделяемые антитела могут существовать в виде единичной Y-образной структуры, мономера. Однако некоторые классы антител также образуют димеры с двумя Ig-единицами (как, например, IgA), тетрамеры с четырьмя Ig-единицами (например, IgM у телеостовых рыб) или пентамеры с пятью Ig-единицами (как IgW у акул или IgM у млекопитающих, который иногда формирует и гексамеры с шестью единицами). IgG также может образовывать гексамеры, при этом J-цепь не требуется. Также описаны тетрамеры и пентамеры IgA. Антитела образуют комплексы, связываясь с антигеном: такие комплексы называются антиген-антитело комплексом или иммунным комплексом. Небольшие антигены могут сшивать два антитела, что также приводит к образованию димеров, тримеров, тетрамеров и т.д. Многовалентные антигены (например, клетки с множеством эпитопов) способны образовывать более крупные комплексы с антителами. Ярким примером является агглютинация – склеивание эритроцитов антителами в тесте Кумбса для определения группы крови: крупные агрегаты становятся нерастворимыми, что приводит к образованию видимого осадка.

Типы легких цепей

У млекопитающих существует два типа легких цепей иммуноглобулина, которые называются лямбда (λ) и каппа (κ). Однако, известных функциональных различий между ними нет, и обе могут встречаться с любым из пяти основных типов тяжелых цепей. Хрящевые рыбы (например, акулы) производят антитела, состоящие только из тяжелых цепей (то есть, не содержащие легких цепей), которые, к тому же, образуют более длинные пентамеры (с пятью постоянными доменами на молекулу). Камелиды (такие как верблюды, ламы, альпаки) также примечательны тем, что производят антитела, состоящие только из тяжелых цепей. + Классы антител, не встречающиеся у млекопитающих Класс Типы Описание IgY Обнаружен у птиц и рептилий; родственный IgG у млекопитающих. IgW Обнаружен у акул и скатов; родственный IgD у млекопитающих. IgT/Z Обнаружен у телеостовых рыб.

Взаимодействие антитела-антигена

Паратоп антитела взаимодействует с эпитопом антигена. Антиген обычно содержит различные эпитопы на своей поверхности, расположенные дискретно, а доминирующие эпитопы на данном антигене называются детерминантами. Антитело и антиген взаимодействуют благодаря пространственной комплементарности (принцип "ключ-замок"). Молекулярные силы, участвующие во взаимодействии эпитопа Fab, слабые и неспецифические – например, электростатические силы, водородные связи, гидрофобные взаимодействия и силы Ван-дер-Ваальса. Это означает, что связывание антитела и антигена обратимо, а аффинность антитела к антигену является относительной, а не абсолютной. Относительно слабое связывание также означает, что антитело может демонстрировать перекрестную реактивность с различными антигенами, обладающими разной относительной аффинностью.

Активация комплемента

Антитела, связывающиеся с поверхностными антигенами (например, на бактериях), посредством своего Fc-фрагмента привлекают первый компонент каскада комплемента и инициируют активацию "классического" пути комплемента.

Активация эффекторных клеток

Чтобы бороться с патогенами, размножающимися вне клеток, антитела связываются с ними, соединяя их вместе и вызывая агглютинацию. Поскольку антитело имеет как минимум два паратопа, оно способно связываться с несколькими антигенами, узнавая идентичные эпитопы, расположенные на их поверхности. Покрывая патоген, антитела стимулируют эффекторные функции против него в клетках, распознающих Fc-фрагмент. Отторжение ксенотрансплантированных органов, как полагают, частично обусловлено связыванием циркулирующих в сыворотке реципиента природных антител с α-Gal антигенами, экспрессируемыми в ткани донора.

Разнообразие иммуноглобулинов

Практически все микробы способны вызывать иммунный ответ с участием антител. Успешное распознавание и уничтожение множества различных типов микробов требует разнообразия антител; вариации в их аминокислотном составе позволяют им взаимодействовать с широким спектром антигенов. По оценкам, у человека вырабатывается около 10 миллиардов различных антител, каждое из которых способно связываться с уникальным эпитопом антигена. Несмотря на огромный репертуар антител, генерируемый у одного человека, число генов, доступных для синтеза этих белков, ограничено размером генома человека. В ходе эволюции сформировалось несколько сложных генетических механизмов, позволяющих В-клеткам позвоночных создавать разнообразный пул антител из относительно небольшого числа генов антител.

Изменчивость домена

Хромосомная область, кодирующая антитело, велика и содержит несколько различных генных локусов для каждого домена антитела — хромосомная область, содержащая гены тяжелой цепи (IGH@), находится на хромосоме 14, а локусы, содержащие гены легких цепей лямбда и каппа (IGL@ и IGK@), находятся на хромосомах 22 и 2 у человека. Одна из этих областей называется переменным доменом, который присутствует в каждой тяжелой и легкой цепи каждого антитела, но может различаться в разных антителах, генерируемых из различных B-клеток. Различия между переменными доменами локализованы в трех петлях, известных как гипервариантные области (HV 1, HV 2 и HV 3) или области, определяющие комплементарность (CDR1, CDR2 и CDR3). CDR поддерживаются в пределах переменных доменов консервативными каркасными областями. Локус тяжелой цепи содержит около 65 различных генов переменного домена, которые все отличаются по своим CDR. Комбинирование этих генов с набором генов для других доменов антитела создает огромное разнообразие антител с высокой степенью вариабельности. Эта комбинация называется V(D)J-рекомбинацией, которая обсуждается ниже.

V ((D) J рекомбинация

Соматическая рекомбинация иммуноглобулинов, также известная как V(D)J-рекомбинация, включает в себя создание уникальной вариабельной области иммуноглобулина. Вариабельная область каждой тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина кодируется несколькими фрагментами, известными как генные сегменты (подгены). Эти сегменты называются вариабельными (V), диверсити (D) и джоининговыми (J) сегментами. Перестройка нескольких подгенов (например, семейства V2) для иммуноглобулина легкой цепи лямбда связана с активацией микроРНК miR-650, которая дополнительно влияет на биологию B-клеток. Белки RAG играют важную роль в V(D)J-рекомбинации, осуществляя разрыв ДНК в определенной области.

Соматическая гипермутация и созревание аффинитета

После активации антигеном В-клетки начинают быстро пролиферировать. В этих быстро делящихся клетках гены, кодирующие вариабельные домены тяжелых и легких цепей, подвергаются высокой частоте точечных мутаций посредством процесса, называемого соматической гипермутацией (SHM). SHM приводит к примерно одному изменению нуклеотида на вариабельный ген в каждом делении клетки. В результате, любые дочерние В-клетки приобретают незначительные различия в аминокислотной последовательности вариабельных доменов цепей антител. Это способствует увеличению разнообразия пула антител и влияет на аффинность антител к антигену. Некоторые точечные мутации приводят к образованию антител с более слабым взаимодействием (низкой аффинностью) с антигеном по сравнению с исходным антителом, а другие мутации генерируют антитела с более сильным взаимодействием (высокой аффинностью). В-клетки, экспрессирующие антитела с высокой аффинностью на своей поверхности, получают сильный сигнал выживания при взаимодействии с другими клетками, в то время как клетки с антителами с низкой аффинностью этого сигнала не получают и погибают посредством апоптоза.

Переход на класс

Смена изотопа или класса – это биологический процесс, происходящий после активации В-клетки, который позволяет клетке производить различные классы антител (IgA, IgE или IgG). Переключение класса происходит в локусе гена тяжелой цепи посредством механизма, называемого рекомбинацией переключения класса (CSR). Этот механизм опирается на консервативные нуклеотидные мотивы, называемые переключающими (S) регионами, расположенными в ДНК выше по течению от каждого гена постоянной области (за исключением δ-цепи). Разрыв цепи ДНК осуществляется активностью ряда ферментов в двух выбранных S-регионах. Переменный домен экзона воссоединяется посредством процесса, называемого негомологичным соединением концов (NHEJ), с желаемой постоянной областью (γ, α или ε). В результате этого процесса формируется ген иммуноглобулина, кодирующий антитело другого изотопа.

Определения специфики

Антитело можно назвать моноспецифическим, если оно обладает специфичностью к одному антигену или эпитопу, или биспецифическим, если оно проявляет аффинность к двум различным антигенам или двум различным эпитопам на одном и том же антигене. Группа антител может быть названа поливалентной (или неспецифической), если они проявляют аффинность к различным антигенам. Внутривенный иммуноглобулин, если не указано иное, состоит из множества различных IgG (поликлональный IgG). В отличие от них, моноклональные антитела – это идентичные антитела, продуцируемые одной B-клеткой.

Асимметричные антитела

Гетеродимерные антитела, также известные как асимметричные антитела, обеспечивают большую гибкость и новые возможности для присоединения различных лекарственных препаратов к антительным "рукам". Один из распространенных форматов гетеродимерных антител – формат "выступ-в-углубление". Этот формат специфичен для константной области тяжелой цепи антител. "Выступ" создается путем замены небольшой аминокислоты на более крупную, а "углубление" – путем замены крупной аминокислоты на меньшую. "Выступы" и "углубления" соединяются дисульфидными связями между цепями. Форма "выступ-в-углубление" способствует антителозависимой клеточной цитотоксичности. Одноцепочечные переменные фрагменты (scFv) соединяются с переменными доменами тяжелой и легкой цепей посредством короткого линкерного пептида. Линкер богат глицином, что обеспечивает ему гибкость, и серином/треонином, что придает специфичность. Два различных scFv фрагмента могут быть соединены через шарнирный регион с константной областью тяжелой или легкой цепи. Это придает антителу биспецифичность, позволяя связываться с двумя различными антигенами. Формат "выступ-в-углубление" усиливает образование гетеродимеров, но не подавляет образование гомодимеров. Для дальнейшего улучшения функциональности гетеродимерных антител многие ученые обращаются к искусственным конструкциям. Искусственные антитела представляют собой разнообразные белковые мотивы, использующие функциональную стратегию антитела, но не ограниченные структурными рамками и петлями природных антител. Возможность контролировать комбинаторный дизайн последовательности и трехмерного пространства позволяет превзойти природный дизайн и присоединять различные комбинации лекарственных препаратов к "рукам". Гетеродимерные антитела могут принимать более широкий спектр форм, а лекарственные препараты, присоединенные к "рукам", не обязательно должны быть одинаковыми, что позволяет использовать различные комбинации препаратов для лечения рака. Фармацевтические компании способны производить высокофункциональные биспецифические и даже мультиспецифические антитела. Степень их функциональности впечатляет, учитывая, что такое изменение формы по сравнению с природной структурой должно приводить к снижению функциональности.

Heterodimeric antibodies, which are also asymmetrical antibodies, allow for greater flexibility and new formats for attaching a variety of drugs to the antibody arms. One of the general formats for a heterodimeric antibody is the "knobs into holes" format. This format is specific to the heavy chain part of the constant region in antibodies. The "knobs" part is engineered by replacing a small amino acid with a larger one. It fits into the "hole", which is engineered by replacing a large amino acid with a smaller one. What connects the "knobs" to the "holes" are the disulfide bonds between each chain. The "knobs into holes" shape facilitates antibody dependent cell mediated cytotoxicity. Single chain variable fragments (scFv) are connected to the variable domain of the heavy and light chain via a short linker peptide. The linker is rich in glycine, which gives it more flexibility, and serine/threonine, which gives it specificity. Two different scFv fragments can be connected together, via a hinge region, to the constant domain of the heavy chain or the constant domain of the light chain. This gives the antibody bispecificity, allowing for the binding specificities of two different antigens. The "knobs into holes" format enhances heterodimer formation but does not suppress homodimer formation. To further improve the function of heterodimeric antibodies, many scientists are looking towards artificial constructs. Artificial antibodies are largely diverse protein motifs that use the functional strategy of the antibody molecule, but are not limited by the loop and framework structural constraints of the natural antibody. Being able to control the combinational design of the sequence and three dimensional space could transcend the natural design and allow for the attachment of different combinations of drugs to the arms. Heterodimeric antibodies have a greater range in shapes they can take and the drugs that are attached to the arms do not have to be the same on each arm, allowing for different combinations of drugs to be used in cancer treatment. Pharmaceuticals are able to produce highly functional bispecific, and even multispecific, antibodies. The degree to which they can function is impressive given that such a change of shape from the natural form should lead to decreased functionality.

Транспозиция межхромосомной ДНК

Диверсификация антител обычно происходит посредством соматической гипермутации, переключения классов и созревания аффинности, направленных на локусы гена BCR, однако в некоторых случаях были задокументированы более необычные формы диверсификации. Например, при малярии, вызываемой Plasmodium falciparum, у некоторых антител людей, ранее инфицированных этим паразитом, была обнаружена вставка из хромосомы 19, содержащая участок в 98 аминокислот из лейкоцит-ассоциированного иммуноглобулиноподобного рецептора 1, LAIR1, в области локтевого сустава. Это представляет собой форму межхромосомной транспозиции. LAIR1 обычно связывается с коллагеном, но способен распознавать повторяющиеся интерсперсные семейства полипептидов (RIFIN), которые высоко экспрессируются на поверхности эритроцитов, инфицированных P. falciparum. Фактически, эти антитела подверглись аффинному созреванию, которое усилило их аффинность к RIFIN, но при этом утратили аффинность к коллагену. Эти "антитела, содержащие LAIR1" были обнаружены у 5–10% доноров из Танзании и Мали, но не у европейских доноров. Однако у европейских доноров также были выявлены участки длиной от 100 до 1000 нуклеотидов в области локтевых суставов. Это специфическое явление, вероятно, связано с малярией, поскольку известно, что инфекция индуцирует геномную нестабильность.

История

Термин "антитело" впервые был использован в тексте Пола Эрлиха. Термин Antikörper (немецкое слово для антитела) появляется в заключении его статьи "Экспериментальные исследования иммунитета", опубликованной в октябре 1891 года, в которой утверждается, что "если два вещества порождают два различных Antikörper, то они сами должны быть различными". Однако термин не был принят сразу, и было предложено несколько других терминов для антитела, включая Immunkörper, Amboceptor, Zwischenkörper, вещество-сенсибилизатор, копула, Desmon, филоцитаза, фиксатор и Immunisin. Созданное для кампуса Исследовательского института Скриппса во Флориде, антитело помещено в кольцо, отсылающее к "Витрувианскому человеку" Леонардо да Винчи, тем самым подчеркивая сходство антитела и человеческого тела. Изучение антител началось в 1890 году, когда Эмиль фон Беринг и Китасато Шибасабуро описали антительную активность против токсинов дифтерии и столбняка. Фон Беринг и Китасато выдвинули теорию гуморального иммунитета, предположив, что медиатор в сыворотке может реагировать с чужеродным антигеном. Эта идея побудила Пола Эрлиха предложить теорию боковых цепей для взаимодействия антител и антигенов в 1897 году, когда он предположил, что рецепторы (описанные как "боковые цепи") на поверхности клеток могут специфически связываться с токсинами – в соответствии с принципом "ключ и замок" – и что эта связывающая реакция является триггером для производства антител. Другие исследователи полагали, что антитела свободно существуют в крови, и в 1904 году Альмрот Райт предположил, что растворимые антитела покрывают бактерии, маркируя их для фагоцитоза и уничтожения; процесс, который он назвал опсонизацией. В 1920-х годах Майкл Хайдельбергер и Освальд Эйвери обнаружили, что антигены могут быть осаждаемы антителами, и впоследствии показали, что антитела состоят из белка. Биохимические свойства взаимодействия антигена и антитела были изучены более подробно в конце 1930-х годов Джоном Марраком. Следующий важный прогресс был достигнут в 1940-х годах, когда Линус Полинг подтвердил теорию "ключ и замок", предложенную Эрлихом, показав, что взаимодействие между антителами и антигенами зависит больше от их формы, чем от их химического состава. В 1948 году Астрид Фагреус обнаружила, что В-клетки, в форме плазматических клеток, отвечают за выработку антител. Последующие работы были сосредоточены на характеристике структуры белков антитела. Важным достижением в этих структурных исследованиях стало открытие в начале 1960-х годов Джеральдом Эдельманом и Джозефом Галли легкой цепи антител и их понимание того, что этот белок идентичен белку Бенсе-Джонса, описанному Генри Бенсе-Джонсом в 1845 году. Эдельман впоследствии обнаружил, что антитела состоят из тяжелых и легких цепей, связанных дисульфидными связями. Примерно в то же время Родни Портер охарактеризовал области связывания антител (Fab) и хвостовую область (Fc) IgG. Вместе эти ученые определили структуру и полную аминокислотную последовательность IgG, за что они совместно получили Нобелевскую премию по физиологии или медицине в 1972 году. Хотя большинство этих ранних исследований были сосредоточены на IgM и IgG, другие изотипы иммуноглобулинов были идентифицированы в 1960-х годах: Томас Томаси обнаружил секреторные антитела (IgA); Дэвид С. Роу и Джон Л. Фейхи обнаружили IgD; а Кимисиге Ишизака и Теруко Ишизака обнаружили IgE и показали, что это класс антител, участвующих в аллергических реакциях. В серии основополагающих экспериментов, начавшихся в 1976 году, Сусуму Тонегава показал, что генетический материал может перестраиваться, формируя огромное разнообразие доступных антител.

The first use of the term "antibody" occurred in a text by Paul Ehrlich. The term Antikörper (the German word for antibody) appears in the conclusion of his article "Experimental Studies on Immunity", published in October 1891, which states that, "if two substances give rise to two different Antikörper, then they themselves must be different". However, the term was not accepted immediately and several other terms for antibody were proposed; these included Immunkörper, Amboceptor, Zwischenkörper, substance sensibilisatrice, copula, Desmon, philocytase, fixateur, and Immunisin. Created for the Florida campus of the Scripps Research Institute, the antibody is placed into a ring referencing Leonardo da Vinci's Vitruvian Man thus highlighting the similarity of the antibody and the human body.]] The study of antibodies began in 1890 when Emil von Behring and Kitasato Shibasaburō described antibody activity against diphtheria and tetanus toxins. Von Behring and Kitasato put forward the theory of humoral immunity, proposing that a mediator in serum could react with a foreign antigen. His idea prompted Paul Ehrlich to propose the side chain theory for antibody and antigen interaction in 1897, when he hypothesized that receptors (described as "side chains") on the surface of cells could bind specifically to toxins – in a "lock and key" interaction – and that this binding reaction is the trigger for the production of antibodies. Other researchers believed that antibodies existed freely in the blood and, in 1904, Almroth Wright suggested that soluble antibodies coated bacteria to label them for phagocytosis and killing; a process that he named opsoninization. In the 1920s, Michael Heidelberger and Oswald Avery observed that antigens could be precipitated by antibodies and went on to show that antibodies are made of protein. The biochemical properties of antigen antibody binding interactions were examined in more detail in the late 1930s by John Marrack. The next major advance was in the 1940s, when Linus Pauling confirmed the lock and key theory proposed by Ehrlich by showing that the interactions between antibodies and antigens depend more on their shape than their chemical composition. In 1948, Astrid Fagraeus discovered that B cells, in the form of plasma cells, were responsible for generating antibodies. Further work concentrated on characterizing the structures of the antibody proteins. A major advance in these structural studies was the discovery in the early 1960s by Gerald Edelman and Joseph Gally of the antibody light chain, and their realization that this protein is the same as the Bence Jones protein described in 1845 by Henry Bence Jones. Edelman went on to discover that antibodies are composed of disulfide bond linked heavy and light chains. Around the same time, antibody binding (Fab) and antibody tail (Fc) regions of IgG were characterized by Rodney Porter. Together, these scientists deduced the structure and complete amino acid sequence of IgG, a feat for which they were jointly awarded the 1972 Nobel Prize in Physiology or Medicine. While most of these early studies focused on IgM and IgG, other immunoglobulin isotypes were identified in the 1960s: Thomas Tomasi discovered secretory antibody (IgA); David S. Rowe and John L. Fahey discovered IgD; and Kimishige Ishizaka and Teruko Ishizaka discovered IgE and showed it was a class of antibodies involved in allergic reactions. In a landmark series of experiments beginning in 1976, Susumu Tonegawa showed that genetic material can rearrange itself to form the vast array of available antibodies.

Диагностика заболевания

Обнаружение специфических антител – широко распространенный метод медицинской диагностики, от которого зависят такие области, как серология. Например, при биохимических исследованиях для диагностики заболеваний в крови определяется титр антител к вирусу Эпштейна-Барр или болезни Лайма. Отсутствие этих антител может указывать либо на отсутствие инфекции, либо на то, что инфекция произошла давно, и В-клетки, продуцирующие эти антитела, естественным образом подверглись деградации. В клинической иммунологии уровни отдельных классов иммуноглобулинов измеряются методом нефелометрии (или турбидиметрии) для определения антительного профиля пациента. Повышение уровней различных классов иммуноглобулинов иногда помогает установить причину повреждения печени у пациентов, у которых диагноз не установлен. Тест Кумбса также используется для выявления антител при подготовке к переливанию крови и для скрининга антител у беременных женщин. Антитела к хорионическому гонадотропину человека используются в тестах на беременность, отпускаемых без рецепта. Новая химия диоксаборана позволяет проводить радиоактивную (18F) маркировку антител, что дает возможность визуализировать рак с помощью позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ).

Лечение заболеваний

Целевая терапия моноклональными антителами используется для лечения таких заболеваний, как ревматоидный артрит, рассеянный склероз, псориаз и многие формы рака, включая лимфому Ходжкина, колоректальный рак, рак головы и шеи, а также рак молочной железы. Некоторые иммунодефициты, такие как Х-сцепленная агаммаглобулинемия и гипогаммаглобулинемия, приводят к частичной или полной нехватке антител. Эти заболевания часто лечат, индуцируя кратковременную форму иммунитета, называемую пассивным иммунитетом. Пассивный иммунитет достигается путем переноса готовых антител в виде человеческой или животной сыворотки, пула иммуноглобулинов или моноклональных антител пациенту.

Пренатальная терапия

Rh-фактор, также известный как антиген Rh D, является антигеном, обнаруженным на эритроцитах; у людей, являющихся Rh-положительными (Rh+), этот антиген присутствует на эритроцитах, а у Rh-отрицательных (Rh–) – отсутствует. Во время нормальных родов, при родовой травме или осложнениях во время беременности кровь плода может попасть в кровоток матери. В случае Rh-несовместимости матери и ребенка, смешивание крови может сенсибилизировать Rh-отрицательную мать к антигену Rh на эритроцитах Rh-положительного ребенка, подвергая остальную часть беременности и любые последующие беременности риску гемолитической болезни новорожденных. Иммуноглобулины Rho(D) специфичны для человеческого антигена RhD. Анти-RhD антитела вводятся в рамках пренатального лечения для предотвращения сенсибилизации, которая может возникнуть у Rh-отрицательной матери, вынашивающей Rh-положительного плода. Лечение матери анти-RhD антителами до и сразу после травмы или родов разрушает антиген Rh в организме матери, поступивший от плода. Это происходит до того, как антиген сможет стимулировать B-клетки матери к "запоминанию" антигена Rh путем генерации клеток памяти B. Таким образом, ее гуморальная иммунная система не будет вырабатывать анти-Rh антитела и не будет атаковать антигены Rh нынешнего или последующих детей. Лечение иммуноглобулинами Rho(D) предотвращает сенсибилизацию, которая может привести к Rh-болезни, но не предотвращает и не лечит само заболевание. Для получения антитела, специфичного к одному эпитопу антигена, лимфоциты, секретирующие антитела, выделяют из животного и иммортализуют, сливая их с раковой клеточной линией. Полученные слитые клетки называются гибридомами и постоянно растут и секретируют антитела в культуре. Отдельные гибридомы изолируют методом предельных разведений для получения клеточных клонов, которые производят одно и то же антитело; эти антитела называются моноклональными антителами. Поликлональные и моноклональные антитела часто очищают с использованием Protein A/G или антигенной аффинной хроматографии. В исследованиях очищенные антитела используются в различных приложениях. Антитела для исследовательских целей можно приобрести непосредственно у поставщиков антител или с помощью специализированной поисковой системы. Исследовательские антитела чаще всего используются для идентификации и локализации внутриклеточных и внеклеточных белков. Антитела используются в проточной цитометрии для дифференциации типов клеток по экспрессируемым ими белкам; различные типы клеток экспрессируют различные комбинации кластеров дифференцировки на своей поверхности и производят различные внутриклеточные и секретируемые белки. Они также используются в иммунопреципитации для отделения белков и всего, что с ними связано (коиммунопреципитация), от других молекул в клеточном лизате, в вестерн-блоте для идентификации белков, разделенных электрофорезом, и в иммуногистохимии или иммунофлуоресценции для изучения экспрессии белков в срезах тканей или локализации белков внутри клеток с помощью микроскопа. Белки также могут быть обнаружены и количественно определены с помощью антител, используя методы ELISA и ELISpot. Антитела, используемые в исследованиях, являются одними из самых мощных, но и самых проблемных реагентов, требующих контроля огромного количества факторов в любом эксперименте, включая перекрестную реактивность (когда антитело распознает несколько эпитопов) и аффинность, которая может сильно варьироваться в зависимости от экспериментальных условий, таких как pH, растворитель, состояние ткани и т.д. Предпринято множество попыток улучшить как способы валидации антител исследователями, так и способы их представления в публикациях. Исследователи, использующие антитела в своей работе, должны правильно документировать их, чтобы обеспечить воспроизводимость их исследований (и, следовательно, возможность проверки и квалификации другими исследователями). Менее половины исследовательских антител, упомянутых в научных статьях, можно легко идентифицировать. Статьи, опубликованные в F1000 в 2014 и 2015 годах, предоставляют исследователям руководство по отчетности об использовании антител в исследованиях. Статья RRID опубликована в 4 журналах, которые внедрили стандарт RRID для цитирования исследовательских ресурсов, используя данные с antibodyregistry.org в качестве источника идентификаторов антител (см. также группу Force11). Области антител могут быть использованы для дальнейших биомедицинских исследований, служа направляющими для доставки лекарств к их мишени. Некоторые приложения включают использование бактериальных плазмид для мечения плазмид Fc-фрагментом антитела, например, плазмидой pFUSE Fc.

Rh factor, also known as Rh D antigen, is an antigen found on red blood cells; individuals that are Rh positive (Rh+) have this antigen on their red blood cells and individuals that are Rh negative (Rh–) do not. During normal childbirth, delivery trauma or complications during pregnancy, blood from a fetus can enter the mother's system. In the case of an Rh incompatible mother and child, consequential blood mixing may sensitize an Rh mother to the Rh antigen on the blood cells of the Rh+ child, putting the remainder of the pregnancy, and any subsequent pregnancies, at risk for hemolytic disease of the newborn. Rho(D) immune globulin antibodies are specific for human RhD antigen. Anti RhD antibodies are administered as part of a prenatal treatment regimen to prevent sensitization that may occur when a Rh negative mother has a Rh positive fetus. Treatment of a mother with Anti RhD antibodies prior to and immediately after trauma and delivery destroys Rh antigen in the mother's system from the fetus. This occurs before the antigen can stimulate maternal B cells to "remember" Rh antigen by generating memory B cells. Therefore, her humoral immune system will not make anti Rh antibodies, and will not attack the Rh antigens of the current or subsequent babies. Rho(D) Immune Globulin treatment prevents sensitization that can lead to Rh disease, but does not prevent or treat the underlying disease itself. To obtain antibody that is specific for a single epitope of an antigen, antibody secreting lymphocytes are isolated from the animal and immortalized by fusing them with a cancer cell line. The fused cells are called hybridomas, and will continually grow and secrete antibody in culture. Single hybridoma cells are isolated by dilution cloning to generate cell clones that all produce the same antibody; these antibodies are called monoclonal antibodies. Polyclonal and monoclonal antibodies are often purified using Protein A/G or antigen affinity chromatography. In research, purified antibodies are used in many applications. Antibodies for research applications can be found directly from antibody suppliers, or through use of a specialist search engine. Research antibodies are most commonly used to identify and locate intracellular and extracellular proteins. Antibodies are used in flow cytometry to differentiate cell types by the proteins they express; different types of cells express different combinations of cluster of differentiation molecules on their surface, and produce different intracellular and secretable proteins. They are also used in immunoprecipitation to separate proteins and anything bound to them (co immunoprecipitation) from other molecules in a cell lysate, in Western blot analyses to identify proteins separated by electrophoresis, and in immunohistochemistry or immunofluorescence to examine protein expression in tissue sections or to locate proteins within cells with the assistance of a microscope. Proteins can also be detected and quantified with antibodies, using ELISA and ELISpot techniques. Antibodies used in research are some of the most powerful, yet most problematic reagents with a tremendous number of factors that must be controlled in any experiment including cross reactivity, or the antibody recognizing multiple epitopes and affinity, which can vary widely depending on experimental conditions such as pH, solvent, state of tissue etc. Multiple attempts have been made to improve both the way that researchers validate antibodies and ways in which they report on antibodies. Researchers using antibodies in their work need to record them correctly in order to allow their research to be reproducible (and therefore tested, and qualified by other researchers). Less than half of research antibodies referenced in academic papers can be easily identified. Papers published in F1000 in 2014 and 2015 provide researchers with a guide for reporting research antibody use. The RRID paper, is co published in 4 journals that implemented the RRIDs Standard for research resource citation, which draws data from the antibodyregistry. org as the source of antibody identifiers (see also group at Force11). Antibody regions can be used to further biomedical research by acting as a guide for drugs to reach their target. Several application involve using bacterial plasmids to tag plasmids with the Fc region of the antibody such as pFUSE Fc plasmid.

До клинических испытаний

Испытания безопасности продукции: стерильность (бактерии и грибки), in vitro и in vivo тестирование на наличие посторонних вирусов, тестирование на мышиные ретровирусы, данные о безопасности продукта, необходимые перед началом исследований осуществимости в серьезных или представляющих непосредственную угрозу для жизни состояниях; они служат для оценки потенциальной опасности продукта. Исследования осуществимости: это пилотные исследования, целью которых является, в том числе, ранняя характеристика безопасности и первоначальное подтверждение концепции в небольшой, специфической группе пациентов (in vitro или in vivo тестирование).

Прогнозирование структуры и вычислительная конструкция антител

Важность антител в здравоохранении и биотехнологической промышленности обуславливает необходимость знания их структуры с высоким разрешением. Эта информация используется для разработки белков, модификации аффинности связывания антигена и идентификации эпитопа конкретного антитела. Рентгеновская кристаллография – один из распространенных методов определения структуры антител. Однако кристаллизация антитела часто является трудоемким и длительным процессом. Вычислительные подходы предлагают более дешевую и быструю альтернативу кристаллографии, но их результаты менее однозначны, поскольку они не дают эмпирических структур. Онлайн-веб-серверы, такие как Web Antibody Modeling (WAM) и Prediction of Immunoglobulin Structure (PIGS), позволяют проводить вычислительное моделирование вариабельных областей антител. Rosetta Antibody – это новый сервер для предсказания структуры FV-области антител, который использует сложные методы для минимизации CDR-петель и оптимизации относительной ориентации легких и тяжелых цепей, а также гомологичные модели, предсказывающие успешное докинг антител с их уникальным антигеном. Однако описание сайта связывания антитела, основанное только на одной статической структуре, ограничивает понимание и характеристику функции и свойств антитела. Для улучшения предсказания структуры антител и учета сильно коррелированных движений CDR-петель и интерфейса, паратопы антител следует описывать как взаимопревращающиеся состояния в растворе с различными вероятностями. Было представлено несколько методов вычислительного дизайна антител, основанных на структурно-биоинформатических исследованиях CDR антител. Существует множество методов секвенирования антител, включая деградацию Эдмана, cDNA и другие; однако одним из наиболее распространенных современных методов идентификации пептидов/белков является жидкостная хроматография, соединенная с тандемной масс-спектрометрией (LC MS/MS). Методы высокопроизводительного секвенирования антител требуют вычислительных подходов для анализа данных, включая de novo секвенирование непосредственно из тандемных масс-спектров и методы поиска в базах данных, использующих существующие базы данных последовательностей белков. Многие варианты секвенирования белков методом «дробовика» способны увеличить покрытие за счет использования фрагментации CID/HCD/ETD и других методов, и достигли значительного прогресса в попытках полностью секвенировать белки, особенно антитела. Другие методы предполагают существование схожих белков, известную последовательность генома или комбинированные подходы «сверху вниз» и «снизу вверх». Современные технологии позволяют собирать последовательности белков с высокой точностью, интегрируя пептиды, полученные методом de novo секвенирования, интенсивность и показатели позиционной достоверности из баз данных и результатов поиска гомологии.

The importance of antibodies in health care and the biotechnology industry demands knowledge of their structures at high resolution. This information is used for protein engineering, modifying the antigen binding affinity, and identifying an epitope, of a given antibody. X ray crystallography is one commonly used method for determining antibody structures. However, crystallizing an antibody is often laborious and time consuming. Computational approaches provide a cheaper and faster alternative to crystallography, but their results are more equivocal, since they do not produce empirical structures. Online web servers such as Web Antibody Modeling (WAM) and Prediction of Immunoglobulin Structure (PIGS) enable computational modeling of antibody variable regions. Rosetta Antibody is a novel antibody FV region structure prediction server, which incorporates sophisticated techniques to minimize CDR loops and optimize the relative orientation of the light and heavy chains, as well as homology models that predict successful docking of antibodies with their unique antigen. However, describing an antibody's binding site using only one single static structure limits the understanding and characterization of the antibody's function and properties. To improve antibody structure prediction and to take the strongly correlated CDR loop and interface movements into account, antibody paratopes should be described as interconverting states in solution with varying probabilities. Several methods have been presented for computational design of antibodies based on the structural bioinformatics studies of antibody CDRs. There are a variety of methods used to sequence an antibody including Edman degradation, cDNA, etc. ; albeit one of the most common modern uses for peptide/protein identification is liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC MS/MS). High volume antibody sequencing methods require computational approaches for the data analysis, including de novo sequencing directly from tandem mass spectra and database search methods that use existing protein sequence databases. Many versions of shotgun protein sequencing are able to increase the coverage by utilizing CID/HCD/ETD fragmentation methods and other techniques, and they have achieved substantial progress in attempt to fully sequence proteins, especially antibodies. Other methods have assumed the existence of similar proteins, a known genome sequence, or combined top down and bottom up approaches. Current technologies have the ability to assemble protein sequences with high accuracy by integrating de novo sequencing peptides, intensity, and positional confidence scores from database and homology searches.

Миметические антитела

Миметики антител – это органические соединения, подобные антителам, способные специфически связываться с антигенами. Они состоят из искусственных пептидов или белков, либо нуклеиновых кислот на основе аптамеров, с молярной массой примерно от 3 до 20 кДа. Фрагменты антител, такие как Fab и нанободи, не рассматриваются как миметики антител. К общим преимуществам по сравнению с антителами относятся лучшая растворимость, проникновение в ткани, стабильность к воздействию тепла и ферментов, а также относительно низкая стоимость производства. Миметики антител разрабатываются и выводятся на рынок как реагенты для исследований, диагностики и терапии.

Объединение связывающих антител

BAU (единица связывающих антител, часто выражается как BAU/мл) — это единица измерения, установленная ВОЗ для сопоставления результатов анализов, определяющих один и тот же класс иммуноглобулинов с одинаковой специфичностью.