Флебовирусы: структура, репликация и организация вирусных частиц.

Введение

Род вирусов

Phlebovirus — один из двадцати родов семейства Phenuiviridae в отряде Bunyavirales. Этот род включает 66 видов. Своё название он получил от подсемейства Phlebotominae, переносчиков вируса Naples phlebovirus, который, по утверждениям, восходит к греческому слову phlebos, означающему "вена". Однако правильным словом для обозначения "вены" в древнегреческом языке является флепс (φλέψ).

Вирусология

Флебовирусы – это вирусы с РНК-геномом отрицательной полярности, состоящим из трех сегментов. Малый сегмент (S) кодирует вирусный N-белок и неструктурный белок NSs посредством амбисенсной стратегии кодирования. Сегмент среднего размера (M) кодирует предшественник вирусных гликопротеинов и неструктурных компонентов. Продукт самого большого сегмента (L) является вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой.

Репликация

Флебовирус реплицируется в семиэтапном процессе. Во-первых, прикрепление к клетке происходит благодаря взаимодействию гликопротеинов с клетками-хозяевами. Примерами этого служат межклеточная адгезионная молекула 3, захватывающая неинтегрины (DC SIGN), гепарансульфат (HS) или тяжелая цепь миозина немышечного типа (NMMHC IIA). Во-вторых, в поздней эндосоме низкий pH вызывает слияние в мембране белка Gc. Проникновение вируса Укуниеми (UUKV) стимулируется экспрессией белка, связанного с везикулами 3 (VAMP3). Кроме того, слияние вируса лихорадки долины Рифта (RVFV) в поздних эндосомах ингибируется интерферонин-индуцированными трансмембранными белками 2 и 3 (IFITIM2 и IFITIM3). В-третьих, вирусные и эндосомные мембраны сливаются, обеспечивая высвобождение вирусных рибонуклеопротеиновых комплексов в цитоплазму (которая также является местом вирусной транскрипции и репликации). В-четвертых, предшествующий белок Gn/Gc транслируется в шероховатом эндоплазматическом ретикулуме (ER). Этот предшествующий белок расщепляется сигнальной пептидазой. Синтез вирусного нуклеопротеина и вирусной полимеразы в цитоплазме объединяется с вновь образованными рибонуклеопротеиновыми комплексами геномной РНК (gRNA). В-пятых, для обеспечения правильной сборки GN/Gc необходимы два шаперона ER – связывающий иммуноглобулины белок (BiP) и кальнексин. Gn/Gc также катализируются протеиндисульфид-изомеразой посредством образования дисульфидных связей. Одновременно кальретикулин предотвращает экспорт неправильно свернутого Gn/Gc в аппарат Гольджи. В-шестых, правильно свернутые гетеродимеры Gn/Gc транспортируются в аппарат Гольджи. Цитоплазматические участки Gn в процессе почкования ассоциируются с РНК-белковыми комплексами (RNP) в этот момент времени. В-седьмых, после завершения почкования новых вирусных частиц везикулы, содержащие вирус, транспортируются к плазматической мембране для высвобождения посредством экзоцитоза.

Роль Gn и Gc в попадании флебовируса

Исследование семейства буньявиридов показало, что частицы буньявируса плеоморфны. Этот известный факт вызвал некоторое удивление, когда исследования показали, что частицы UUKKV и RVFV имеют сферическую форму и высоко упорядочены. Конфигурация белков Gn и Gc в вирусной оболочке определяет порядок частиц. Вирусная оболочка формирует икосаэдрическую решетку с числом триангуляции 12. Также в состав решетки входят 110 гексаметрических и 12 пентаметрических капсомеров. В частности, для RVFV 720 гетеродимеров Gn/Gc включены в капсомеры. В этих случаях Gn формирует шипы капсомера, в то время как Gc находится ближе к липидной мембране, таким образом располагаясь под ним. pH окружающей среды капсомера в конечном итоге определяет его форму. Это во многом связано с протонацией, вызывающей конформационные изменения в Gc, обычно вовлеченные в слияние мембран. Была предложена модель сборки оболочки RVFV, состоящая из димеров Gc, расположенных горизонтально относительно вирусной мембраны. Это известно, поскольку эктодомен RVFV Gc кристаллизуется в виде димера. Это противопоставляется внутреннему вириону буньявирусов, который не имеет матричного белка и, следовательно, не имеет четкой организации. Это означает, что на поверхности вириона белки Gc и Gn должны присутствовать в высоко упорядоченном расположении. Для начала проникновения частицы флебовируса связываются с различными компонентами плазматической мембраны. Эти компоненты взаимодействуют с вирусными гликопротеинами флебовируса и регулируют эффективность проникновения. Хотя эти компоненты не критичны для самого проникновения вируса, рецепторы являются компонентами плазматической мембраны, которые связываются с гликопротеинами и имеют решающее значение для проникновения. В флебовирусах было установлено, что взаимодействия белков гликана играют решающую роль в проникновении флебовируса. Гепарансульфат (ГС) является еще одним важным компонентом при прикреплении флебовируса. Это гликозаминогликан (GAG), представляющий собой неразветвленный полисахарид, состоящий из повторяющихся дисахаридных звеньев, что приводит к образованию протеогликана. Были проанализированы клеточные линии с определенными дефектами гликозилирования, и было показано, что ГС необходим для проникновения RVFV. Это было подтверждено удалением ГС с помощью фермента. Взаимодействие ГС с вирусными частицами зависит от заряда, и исследования показали, что на белке P78 присутствуют кластеры основных аминокислот, которые взаимодействуют с отрицательными кластерами сульфатов на ГС. Для сравнения, места связывания ГС на Gn и Gc не были идентифицированы. Белок P78 в изобилии присутствует в инфицированных RVFV клетках насекомых, в то время как инфицированные клетки млекопитающих производят значительно меньше белков P78. Белок P78 гораздо эффективнее продуцируется в RVFV в клетках комаров, поскольку он необходим для распространения вируса у комаров. В целом, клеточная линия сильно зависит от ГС при проникновении RVFV. Компьютерное исследование предоставило доказательства того, что белки Gc флебовируса могут быть мембранными белками слияния класса II. Окончательное подтверждение этой теории было получено путем выяснения структуры эктодомена RVFV Gc в его предслиятельном состоянии. Gc имеет три домена с характеристиками, напоминающими другие белки класса II. Был обнаружен внутренний цикл слияния, который является критическим аспектом всех белков класса II. Расположение гистидина в Gc напоминает функцию определения pH, что соответствует характеристикам класса II. Хотя в структуре RVFV Gc и белков класса II было много сходств, интерфейс между доменами I и II в RVFV Gc более жесткий и крупный, чем у других белков класса II. Кроме того, RVFV Gc имеет больше дисульфидных мостиков, централизованных в разных местах, чем другие сравниваемые белки. Однако его общая структура и функциональность наиболее напоминают мембранный белок слияния класса II по сравнению с любым другим классом. Функция определения pH в белке Gc заслуживает внимания. Мембранная активность слияния белков флебовируса Gc сильно зависит от pH, поскольку низкий pH запускает транспорт вирионов в эндолизосомы. Повышение внутривезикулярного pH ингибирует проникновение флебовируса. Однако до сих пор неясно, должны ли белки Gc связываться с рецептором, прежде чем быть активированными pH или нет. После слияния вирусной и эндосомной мембран геномные сегменты L, M и S (связанные с вирусной полимеразой) высвобождаются в цитоплазму. Это инициирует транскрипцию геномной РНК в мРНК. Вирусные белки начинают транслироваться еще до завершения транскрипции мРНК. Гн и Гц флебовирусные белки кодируются на M-сегменте и подвергаются синтезу. Прекурсор Gn/Gc не может быть обнаружен в клетке, уже инфицированной флебовирусом. Он становится видимым только после экспрессии M-сегмента. Если присутствуют микросомальные мембраны, прекурсор расщепляется, что указывает на расщепление фактором хозяина во время синтеза вирусного белка. Комплекс сигнальной пептидазы в мембране ЭР отвечает за расщепление прекурсора. Затем этот прекурсор транслоцируется в просвет ЭР, в котором вставляются два гидрофобных домена, между которыми находится третий, расщепленный гидрофобный домен.

A study of the family Bunyaviridae showed that bunyavirus particles are pleomorphic. This known fact cased some surprise when studies showed that UUKKV and RVFV particles are spherically shaped and highly ordered. The configuration of Gn and Gc proteins in the viral envelope imposes the order of the particle. The viral envelope forms an icosahedral lattice with a triangulation number of 12. Also included in the lattice composition are 110 hexametric and 12 pentameric capsomeres. For RVFV in particular, 720 Gn/Gc heterodimers are included in the capsomeres. In these cases, Gn forms the spikes of the capsomere while Gc is closer to the lipid membrane, thus placing it underneath. The pH surrounding the capsomere ultimately determines its shape. This is largely due to protonation triggering conformational changes in Gc, commonly included with membrane fusion. An assembly model for the RVFV envelope has been proposed which consists of Gc dimers positioned horizontally with respect to the viral membrane. This is known because the RVFV Gc ectodomain is crystallized as a dimer. This is opposed to the virion interior of bunyaviruses which has no matrix protein, and thus, has no defining organization. This means that on the virion surface, the Gc and Gn proteins must be present in a highly ordered placement. To begin entry, phlebovirus particles bind to various components of the plasma membrane. These components interact with the viral glycoproteins of phlebovirus and regulate entry efficiency. While these components are not crucial to the actual entry of the virus itself, receptors are components of the plasma membrane that bind to the glycoproteins and are critical for entry. In Phleboviruses, it was determined that glycan protein interactions play a crucial role in phlebovirus entry. Heparan Sulfate (HS) is another crucial component aspect in Phlebovirus attachment. It is a glycosaminoglycan (GAG), which is an unbranched polysaccharide made of disaccharide repeats, that results in the creation of a proteoglycan. Cell lines with defined glycosylation defects were analyzed and showed that HS is necessary for the entry of RVFV. This was confirmed by the removal of HS using an enzyme. HS is charge dependent in their interactions with virus particles, and studies showed that there are basic amino acid clusters on the P78 protein that interact with negative sulfate clusters on HS. In comparison, there were no identified HS binding sites on Gn and Gc. The P78 protein is plentiful in RVFV infected cells in insects, while infected cells in mammals produce significantly less P78 proteins. The P78 protein is much more efficiently produced in RVFV in mosquito cells as it is required for viral spread in mosquitos. Overall, the cell line is heavily dependent on HS in RVFV entry. A computational study provided evidence that phlebovirus Gc proteins might be class II membrane fusion proteins. Final proof for this theory was given by the elucidation of the ectodomain's structure of RVFV Gc in its pre fusion status. Gc has three domains with characteristics that resembled other class II proteins. An internal fusion loop was discovered, which is a critical aspect of all class II proteins. The location of a histidine in Gc resembled a pH sensing feature, which matches class II characteristics. Although there were many similarities within the structure of the RVFV Gc and class II proteins, the interface between domains I and II in RVFV Gc is more rigid and bigger than other class II proteins. Additionally, RVFV Gc has more disulfide bridges centralized in different locations than the other compared proteins. However, its overall structure and functionality is most closely resembling a class II membrane fusion protein compared to any other class. The pH sensing feature in the Gc protein is of note. The membrane fusion activity of the phlebovirus Gc proteins is very dependent on pH, as a low pH triggers the transport of virions into endolysosomes. Elevating intravesicular pH inhibits phlebovirus entry. However, it is still unclear whether Gc proteins must bind to a receptor before being triggered by pH or not. After the viral and endosomal membranes have been fused together, the L,M, and S genomic segments (associated with viral polymerase) are released into the cytoplasm. This initiates the transcription to genomic RNA into mRNA. Viral proteins begin undergoing translation before the transcription of mRNA has finished. The Gn and Gc phlebovirus proteins are encoded on the M segment and undergo synthesis. The precursor Gn/Gc protein cannot be detected in a cell already infected with phlebovirus. It only is visible after the expression of the M segment. If microsomal membranes are present, the precursor is cleaved, indicating cleaving by a host factor during the synthesis of the viral protein. The signal peptidase complex in the ER membrane is responsible for the cleaving of the precursor. This precursor is then translocated into the ER lumen, in which two hydrophobic domains are inserted with a third, cleaved hydrophobic domain in between.

Новая группа патогенных микроорганизмов, передающихся членистоногими

Флебовирусы – это арбовирусы, таксономически разделенные на вирусы, переносимые клещами и двукрылыми насекомыми. Пясочники рода *Phlebotomus* являются основными источниками флебовирусов, передаваемых двукрылыми, за исключением вируса лихорадки долины Рифта (RVFV связан с комарами и имеет более широкий спектр переносчиков). Поддержание вирусов в основном осуществляется через виды-переносчики посредством вертикальной (трансовариальной) передачи. Возрастает обеспокоенность по поводу возможного заноса RVFV в восприимчивые регионы в связи с расширением ареала распространения видов-переносчиков. Потенциальные последствия этого распространения могут привести к значительным экономическим потерям из-за ущерба, наносимого животноводству. Два новых члена группы флебовирусов были идентифицированы как возбудители тяжелых заболеваний человека. В сельской местности Китая вирус SFTSV, передающийся клещами, был обнаружен в результате увеличения числа случаев лихорадочного заболевания, сопровождающегося тромбоцитопенией, лейкоцитопенией, полиорганной недостаточностью и высокой летальностью. После этого открытия о SFTSV также сообщалось в Японии и Корее. В Северной Америке был зарегистрирован аналогичный случай, вызванный вирусом Heartland, который также передается клещами. Эти два открытия изменили представление об опасности флебовирусов, передаваемых клещами, для здоровья населения. Это привело к переклассификации вируса Бханджа (BHAV) в группу флебовирусов, переносимых клещами. В Средиземноморском регионе зарегистрированы новые случаи заболеваний, связанных с флебовирусами. Примеры включают вирус лихорадки песчаной мухи Турции, вирус Адрии, вирус Гранады, вирус Аданы и вирус Меджерды, среди прочих. Вирус Тосканы характеризуется высокой скоростью вертикальной передачи, что было продемонстрировано в экспериментальных условиях на песчаных мухах. Это указывает на важную роль позвоночных хозяев, несмотря на то, что поддержание вирусов в природе в основном обеспечивается песчаными мухами. Под термином «песчаная муха» объединяются представители любых видов или родов летающих, кровососущих двукрылых насекомых, обитающих в песчаных местностях. Например, в Соединенных Штатах «песчаной мухой» называют конских мух или представителей семейства Ceratopogonidae. В других частях мира «песчаной мухой» называют представителей подсемейства Phlebotominae в составе Psychodidae. Два из трех основных родов – *Phlebotomus* и *Sergentomyia* – встречаются в Старом Свете и включают основные виды, переносящие вирусные патогены. Третий род – *Lutzomyia* – встречается в Новом Свете. Другие примеры включают кусающих мошек, или *Austrosimulium*, и черную муху, обитающую в Новой Зеландии. Многие из этих вирусов вызывают лихорадку. Лихорадки, вызываемые *Pappataci* или *Phlebotomus*, – это легкие трехдневные лихорадки, сходные с гриппом и характеризующиеся быстрым началом. Они наиболее распространены в эндемичных районах в летние месяцы, особенно в августе, когда песчаные мухи наиболее активны. Более тяжелые случаи включают вирус Тосканы, связанный с менингитом у людей, и вирус лихорадки долины Рифта, который вызвал масштабные эпидемии среди скота в Африке.

Phleboviruses are arboviruses taxonomically split into tick and dipteran borne viruses. Phlebotomus sandflies are the primary sources for dipteran borne phleboviruses, with Rift Valley fever virus being the exception (RVFV is associated with mosquitos and has a greater variety in its vector range). Maintenance of the viruses is mainly completed through the vector species by means of vertical (transovarial) transmission. Concerns over the potential introduction of RVFV into susceptible areas has grown due to the increasing spread of vector species. The potential ramifications of this spread could cause massive economic loss through the harming of livestock. Two new members of phlebovirus as causative agents of traumatic human disease have been identified. In rural China, SFTSV, which is transmitted by ticks, was identified as the result of increased cases of a febrile illness combined with thrombocytopenia, leukenocytopenia, multiple organ dysfunction, and a high case fatality rate. After this discovery, SFTSV was reported in Japan and Korea as well. North America had a similar case, which was found to be a result of the Heartland virus, which is transmitted by ticks. These two discoveries changed the perception of the effect of tick borne phleboviruses with regards to public health. These discoveries caused the re classification of the Bhanja virus (BHAV) into the tick borne phlebovirus group. Novel associations of phlebovirus diseases have been reported in the Mediterranean area. Examples include the sandfly fever Turkey virus, Adria virus, Granada virus, Adana virus, and Medjerda virus, among others. The Toscana virus has a high rate of vertical transmission, as demonstrated in sandflies through experimental infection. This suggests that there is an amplified role for vertebrate hosts despite the maintenance in nature coming mainly from sandflies. A sandfly is a name for members of any species or genus of flying, blood sucking dipteran in sandy areas. For example, "sandfly" in the United States refers to horse flies or members of the family Ceratopogonidae. In other parts of the world, "sandfly" refers to members of the subfamily Phlebotominae within Psychodidae. Two of the three main genera were found in the Old World, Phlebotomus and Sergentomyia, and contain the prominent species that transmit the viral pathogens. The third genera was found in the New World and is called Lutzomyia. Other examples are biting midges, or Austrosimulium, a black fly found in New Zealand. The result of many of these viruses are some sort of fever. Pappataci fevers, or Phlebotomus fevers, are mild 3 day fevers that are similar to influenza and have a rapid onset. They are most common in endemic areas during the summer months, particularly August, which is when sandflies are active. Some more extreme cases are the Toscana virus, which is associated with meningitis in humans, and the Rift Valley fever virus which has caused wide spread epidemics in livestock in Africa.

Клиническое значение

Следующие двенадцать вирусов были связаны с заболеваниями у людей: флебовирус Аленкера, вирус Бханья, флебовирус Кандиру, вирус Чагреса, флебовирус песчаной лихорадки Неаполя, флебовирус Пунта-Торо, вирус лихорадки долины Рифта, Сицилийский флебовирус, Флебовирус Тосканы, вирус Укуниеми, бандавирус Хартленда (первый известный флебовирус, передающийся клещами и вызывающий заболевания в Западном полушарии, обнаруженный в 2009 году), и вирус песчаной лихорадки Турции (обнаруженный в Китае в 2011 году). Они вызывают симптомы, варьирующиеся от кратковременных, самоограничивающихся лихорадок, таких как лихорадка паппатачи, до энцефалита и смертельной вирусной геморрагической лихорадки.

Таксономия

Флебовирус происходит от Phlebotominae – таксона переносчиков, включающего песчаную лихорадку Неаполя. Название происходит от греческого корня «флебос», означающего «вена». Ранее виды в роде определялись на основе серологической перекрестной реактивности. Изменение правил классификации было вызвано сложностью обнаружения новых флебовирусов в серологических исследованиях. В результате, видовая принадлежность теперь определяется на основании 95% или более идентичности аминокислотных последовательностей их РНК-зависимой РНК-полимеразы (RdRp). В настоящее время род включает 67 видов. Некоторые вирусы используют других кровососущих членистоногих в качестве основных переносчиков. Примерами служат комары для вируса лихорадки долины Рифт и вирус Мукава, который был выделен от клещей, но остается в роде Phlebovirus, несмотря на общую тенденцию переноса вирусов, передаваемых клещами, из Phlebovirus в Uukuvirus. Помимо клещей и комаров, некоторые флебовирусы были выделены от позвоночных, таких как грызуны в Америке и опоссумы или ленивцы в Африке. Такое разнообразие источников указывает на возможность существования различных эпидемиологических циклов. Признаны следующие виды: и группа Кайзоди.