Введение
Химическое вещество, используемое для обнаружения и количественного определения бактериальных эндотоксинов
Лимулусный амебоцитный лизат (LAL) – это водный экстракт подвижных клеток крови (амебоцитов) атлантического подковообразного краба *Limulus polyphemus*. LAL реагирует с бактериальными эндотоксинами, такими как липополисахариды (LPS), которые являются компонентами бактериальной капсулы, внешней мембраны клеточной стенки грамотрицательных бактерий. Эта реакция лежит в основе LAL-теста, широко используемого для обнаружения и количественного определения бактериальных эндотоксинов. В Азии вместо него иногда применяется аналогичный тест на амебоцитный лизат *Tachypleus* (TAL), основанный на местных подковообразных крабах *Tachypleus gigas* или *Tachypleus tridentatus*. Рекомбинантный фактор C (rFC) является альтернативой LAL и TAL, основанной на схожей реакции.
Предыстория
Американский исследователь Фред Банг в 1956 году сообщил, что даже убитые грам-отрицательные бактерии вызывают превращение крови атлантического лимлула (подковы краба) в гель – полутвердую массу. Позже было установлено, что клетки крови этого животного, подвижные клетки, называемые амебоцитами, содержат гранулы с фактором свертывания, известным как коагулоген, который высвобождается из клетки при контакте с бактериальными эндотоксинами. После коагуляции и последующего гелирования, образующийся гель предположительно захватывает бактериальные инфекции в полузакрытой кровеносной системе животного. Современный анализ лизата позволил понять эту каскадную систему, в которой несколько ферментов последовательно работают для образования геля. Начальной точкой свертывания, индуцированного эндотоксинами, является фактор свертывания Limulus C.
В 1977 году Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) одобрило использование LAL для тестирования лекарственных средств, продуктов и медицинских изделий, контактирующих с кровью. До этого для этих целей использовался гораздо более медленный и дорогостоящий тест на кроликах. Атлантических лимлулов отлавливают и извлекают кровь из их перикарда. Часть крабов возвращают в воду, а остальных продают в пищу или используют в качестве наживки. Компании, занимающиеся добычей LAL из атлантических лимлулов, утверждали до 2008 года, что уровень смертности не превышал 3%. Однако исследование, проведенное в 2009 году Массачусетским отделом морского рыболовства, показало, что более ранние исследования выявили смертность от 5 до 15% среди самцов и оценку в 29% среди самок. Само исследование показало смертность в 22% среди самок, возвращенных в воду сразу после взятия крови, и 30% среди самок, оставленных на ночь, что имитирует коммерческую практику. Клетки крови отделяют от сыворотки методом центрифугирования, а затем помещают в дистиллированную воду, что вызывает их набухание и разрушение (лиз). Это высвобождает химические вещества изнутри клеток (лизат), который затем очищают и лиофилизируют. Для проверки образца на наличие эндотоксинов его смешивают с лизатом и водой; наличие эндотоксинов определяется по возникновению коагуляции.
Тест LAL
Существует три основных методологии: метод гелевого сгустка, турбидиметрический и хромогенный. Основное применение LAL – тестирование парентеральных фармацевтических препаратов и медицинских изделий, контактирующих с кровью или спинномозговой жидкостью. В Соединенных Штатах FDA опубликовало руководство по валидации LAL-теста в качестве теста на эндотоксины для таких продуктов. Каскад LAL также запускается (1,3) β-D-глюканом посредством другого фактора G. Как бактериальные эндотоксины, так и (1,3) β-D-глюкан рассматриваются как молекулярные паттерны, связанные с патогенами, или PAMP – вещества, вызывающие воспалительные реакции у млекопитающих.
Преодоление торможения и усиление
Одним из самых трудоемких аспектов тестирования на эндотоксины с использованием LAL является предварительная обработка образцов для устранения влияния веществ, подавляющих или искажающих результаты анализа, что может повлиять на количественное определение эндотоксинов. Если при тестировании продукта наблюдается более низкое, чем ожидаемое, восстановление эндотоксинов, значит, продукт оказывает ингибирующее действие на тест LAL. Продукты, вызывающие более высокие, чем ожидаемые значения, оказывают усиливающее действие. FDA требует устранения ингибирующих и усиливающих свойств продукта в процессе валидации теста LAL для его использования при финальном контроле качества инъекционных препаратов и медицинских изделий. Необходимо подтвердить адекватное восстановление эндотоксинов, прежде чем использовать LAL для выпуска продукта.
Рекомбинантный фактор С
Испытание LAL является основным источником зависимости от продуктов животного происхождения в биомедицинской промышленности и представляет собой вызов принципам 3R в отношении использования животных в тестировании. В связи с сообщениями о более высокой, чем ожидалось, смертности, с 2003 года в продаже появился рекомбинантный белковый заменитель для использования в тесте LAL. Этот метод, названный анализом рекомбинантного фактора C (rFC), основан на том же белке фактора свертывания C лимулуса, но производится генетически модифицированными клетками насекомых (конкретная последовательность фактора C, используемая, не обязательно происходит от атлантического краба-подковы). Внедрение теста rFC происходило медленно, но ситуация начала меняться в 2012 году, когда FDA США и европейские органы здравоохранения признали его допустимой альтернативой. Отсутствие упоминания о нем в фармакопеях оставалось проблемой, поскольку не существовало надлежащего стандарта для проведения теста в производственных условиях.
Испытание активации моноцитов
Тест на активацию моноцитов (MAT) — это еще один предлагаемый метод тестирования на эндотоксины, основанный на использовании моноцитов крови человека. Он измеряет высвобождение цитокинов этими клетками в ответ на присутствие пирогенов, по сути, имитируя процесс, посредством которого эти токсины вызывают лихорадку у людей (и кроликов, как в оригинальном тесте на пирогенность). Протокол проведения теста MAT с использованием культивируемых клеток описан в Европейской фармакопее. Недавнее исследование с применением генетически модифицированных моноцитов позволило значительно повысить чувствительность методов обнаружения на основе моноцитов, сократив время выполнения анализа с более чем 20 часов до 2–3 часов.