Цитруллинирование белков: роль в аутоиммунных заболеваниях и физиологии
Citrullination
Цитруллинирование: процесс превращения аргинина в цитруллин в белках. Роль ферментов PAD и ADI, отличие от цикла мочевины. Биология, модификация белка.
Сравнивайте с английским: нажмите на абзац — оригинал откроется в окне. Кнопка EN под абзацем показывает его прямо в тексте.
Содержание
Введение
Биологический процесс
Biological process
Цитруллирование или деиминирование – это превращение аминокислоты аргинина в белке в аминокислоту цитруллин. Цитруллин не входит в число 20 стандартных аминокислот, кодируемых ДНК в генетическом коде. Вместо этого это результат посттрансляционной модификации. Цитруллирование отличается от образования свободной аминокислоты цитруллина как части цикла мочевины или в качестве побочного продукта ферментов семейства синтаз оксида азота. Ферменты, называемые аргининдеиминазами (ADI), катализируют деиминирование свободного аргинина, в то время как белковые аргининдеиминазы или пептидиларгининдеиминазы (PAD) заменяют первичную кетиминную группу (>C=NH) на кетонную группу (>C=O). Аргинин имеет положительный заряд при нейтральном pH, в то время как цитруллин не имеет чистого заряда. Это повышает гидрофобность белка, что может привести к изменениям в его сворачивании, влияя на структуру и функцию. Иммунная система может атаковать цитруллинированные белки, что приводит к аутоиммунным заболеваниям, таким как ревматоидный артрит (РА) и рассеянный склероз (РС). Фибрин и фибриноген могут быть предпочтительными местами для деиминирования аргинина в ревматоидных суставах. Тест на наличие антител к цитруллинированным белкам (АКП) обладает высокой специфичностью (88–96%) для ревматоидного артрита, примерно такой же чувствительностью, как и ревматоидный фактор (70–78%), для диагностики РА, и может быть обнаружен даже до начала клинических проявлений заболевания. Цитруллинированный виментин может быть аутоантигеном при РА и других аутоиммунных заболеваниях и используется для изучения РА. Кроме того, антитела к мутированному цитруллинированному виментину (MCV) могут быть полезны для мониторинга эффективности терапии РА. В ELISA-системе используется генетически модифицированный цитруллинированный виментин (MCV) – естественная изоформа виментина – для повышения эффективности теста. В реакции превращения аргинина в цитруллин один из концевых атомов азота боковой цепи аргинина заменяется на атом кислорода. Таким образом, положительный заряд аргинина (при физиологическом pH) нейтрализуется, что изменяет третичную структуру белка. В ходе реакции расходуется одна молекула воды и образуется аммиак в качестве побочного продукта.
Citrullination or deimination is the conversion of the amino acid arginine in a protein into the amino acid citrulline. Citrulline is not one of the 20 standard amino acids encoded by DNA in the genetic code. Instead, it is the result of a post translational modification. Citrullination is distinct from the formation of the free amino acid citrulline as part of the urea cycle or as a byproduct of enzymes of the nitric oxide synthase family. Enzymes called arginine deiminases (ADIs) catalyze the deimination of free arginine, while protein arginine deiminases or peptidylarginine deiminases (PADs) replace the primary ketimine group (>C=NH) by a ketone group (>C=O). Arginine is positively charged at a neutral pH, whereas citrulline has no net charge. This increases the hydrophobicity of the protein, which can lead to changes in protein folding, affecting the structure and function. The immune system can attack citrullinated proteins, leading to autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis (RA) and multiple sclerosis (MS). Fibrin and fibrinogen may be favored sites for arginine deimination within rheumatoid joints. Test for presence of anti citrullinated protein (ACP) antibodies are highly specific (88–96%) for rheumatoid arthritis, about as sensitive as rheumatoid factor (70–78%) for diagnosis of RA, and are detectable from even before the onset of clinical disease. Citrullinated vimentin may be an autoantigen in RA and other autoimmune diseases, and is used to study RA. Moreover, antibodies against mutated citrullinated vimentin (MCV) may be useful for monitoring effects of RA therapy. An ELISA system utilises genetically modified citrullinated vimentin (MCV), a naturally occurring isoform of vimentin to improve the performance of the test. In the reaction from arginine to citrulline, one of the terminal nitrogen atoms of the arginine side chain is replaced by an oxygen. Thus, arginine's positive charge (at physiological pH) is removed, altering the protein's tertiary structure. The reaction uses one water molecule and yields ammonia as a side product:
Подтипы ПАД
ПАД обнаружены у хордатов, но не у низших животных. У млекопитающих выявлено пять изотипов PAD – PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 и PAD6. Ранее считалось, что PAD5 является уникальным изотипом у человека, однако было показано, что он гомологичен PAD4. Также было установлено, что PAD2 взаимодействует с виментином в скелетных мышцах и макрофагах, вызывая деполимеризацию филаментов, что указывает на его роль в апоптозе. Метилирование и фосфорилирование МБП активны в процессе миелиногенеза. На ранних стадиях развития ЦНС эмбриона деиминация МБП играет ключевую роль в формировании миелиновой оболочки. У взрослых деиминация МБП наблюдается при демиелинизирующих заболеваниях, таких как рассеянный склероз. МБП может по-разному влиять на различные типы клеток в каждом конкретном случае. Экспрессия PAD3 связана с модификацией овечьей шерсти. Цитруллинирование трихоялина обеспечивает его связывание и сшивание кератиновых филаментов, направляя рост волокна шерсти. Основным изотипом, ответственным за это, является PAD4, который деиминирует аргинины и/или монометилированные аргинины в гистонах 3 и 4, подавляя эффекты метилирования аргинина.
PADs are found in chordates but not in lower animals. In mammals five PAD isotypes – PAD1, PAD2, PAD3, PAD4 and PAD6 – have been found. PAD5 was thought to be a unique isotype in humans, however it was shown to be homologous to PAD4. PAD2 has also been shown to interact with vimentin in skeletal muscle and macrophages, causing the filaments to disassemble, suggesting a role in apoptosis. Methylation and phosphorylation of MBP are active during the process of myelinogenesis. In early CNS development of the embryo, MBP deimination plays a major role in myelin assembly. In adults, MBP deimination is found in demyelination diseases such as multiple sclerosis. MBP may affect different cell types in each case. PAD3 expression has been linked to sheep wool modification. Citrullination of trichohyalin allows it to bind and cross link keratin filaments, directing growth of the wool fiber. The main isotype for this is PAD4, which deiminates arginines and/or monomethylated arginines on histones 3 and 4, turning off the effects of arginine methylation.
Аутоиммунные заболевания
При ревматоидном артрите и других аутоиммунных заболеваниях, таких как псориатический артрит, системная красная волчанка и синдром Шегрена, аутоантитела часто атакуют цитруллинированные белки. Обнаружение антител к цитруллинированным белкам является стандартным тестом для диагностики ревматоидного артрита и связано с более тяжелым течением заболевания. Цитруллинированные белки также обнаруживаются в клеточном детрите, сопровождающем разрушение клеток при болезни Альцгеймера, а также после курения сигарет. Таким образом, цитруллинирование, по-видимому, является частью механизма, стимулирующего иммунную систему при аутоиммунных заболеваниях. Однако цитруллинированные белки также могут быть найдены в здоровой слизистой оболочке толстой кишки. Первый всесторонний учебник по деиминации был опубликован в 2014 году.
In rheumatoid arthritis and other autoimmune diseases, such as psoriatic arthritis, systemic lupus erythematosus and Sjögren's syndrome, autoantibodies often attack citrullinated proteins. The presence of anti citrullinated protein antibody is a standard test for rheumatoid arthritis, and it is associated with more severe disease. Citrullinated proteins are also found in the cellular debris accompanying the destruction of cells in alzheimer disease, and after smoking cigarettes. So citrullination seems to be part of the mechanism that stimulates the immune system in autoimmune disease. However, citrullinated proteins can also be found in healthy colon mucosa. The first comprehensive textbook on deimination was published in 2014.
Обнаружение цитруллированных пептидов и белков
Цитруллированные пептиды и белки могут быть обнаружены с использованием антител, нацеленных на цитруллированные остатки, или с помощью протеомных технологий, основанных на масс-спектрометрии. Цитруллинирование аргинина приводит к увеличению моноизотопной массы на +0,984016 Да, которое можно измерить с помощью масс-спектрометрии. Сдвиг массы близок к разнице в массе между различными изотопами пептида (+1,008665), которую можно ошибочно принять за цитруллинированный пептид, особенно на приборах с низким разрешением. Однако это менее актуально для современных масс-спектрометров высокого разрешения и высокой точности. Кроме того, сдвиг массы идентичен сдвигу массы, вызванному деамидированием боковой цепи аминокислот аспарагина или глутамина, которые являются распространенными модификациями. Остатки цитруллина могут быть химически модифицированы бутандионом или биотинилированы перед анализом, что приводит к другому сдвигу массы, и эта стратегия успешно использовалась для облегчения идентификации с помощью масс-спектрометрии. Другой подход заключается в использовании нейтральной потери изоциановой кислоты (HNCO) из остатков цитруллина при низкоэнергетической коллизионной индуцированной диссоциации в масс-спектрометрах. Эта потеря вызывает сдвиг массы на -43,0058 Да, который может быть использован масс-спектрометрами для преимущественного отбора цитруллинированных пептидов для фрагментации (секвенирования). Наконец, можно использовать потерю положительного заряда при физиологическом pH, вызванную цитруллинированием. Перед протеомным анализом "снизу вверх" белки ферментативно расщепляются на пептиды. Обычно используется протеаза трипсин, которая расщепляет после положительно заряженных остатков аргинина и лизина. Однако трипсин не способен расщеплять после остатка цитруллина, который является нейтральным. Неполное расщепление после цитруллинового остатка в сочетании с правильным сдвигом массы может быть использовано в качестве специфичного и чувствительного маркера цитруллинирования, и эта стратегия совместима со стандартными рабочими процессами протеомики "снизу вверх".
Citrullinated peptides and proteins can be detected using antibodies targeting the citrullinated residues, or detected using mass spectrometry based proteomics technologies. Citrullination of arginine results in a monoisotopic mass increase of +0.984016 Da, which can be measured with mass spectrometry. The mass shift is close to the mass difference between the different peptide isotopes of +1.008665 which can be mistaken for a citrullinated peptide, especially on low resolution instruments. However, this is less of an issue with modern high resolution/high accuracy mass spectrometers. Furthermore, the mass shift is identical to the mass shift caused by deamidation of the amino acid asparagine or glutamine side chain, which are common modifications. Citrulline residues can be chemically modified with butanedione or by biotinylation prior to analysis, leading to a different mass shift, and this strategy has successfully been used to facilitate identification by mass spectrometry. Another approach is to utilize the neutral loss of isocyanic acid (HNCO) from citrulline residues when submitted to low energy collision induced dissociation fragmentation in mass spectrometers. The loss causes a mass shift of −43.0058 Da, which can be utilized by mass spectrometers to predominantly select citrullinated peptides for fragmentation (sequencing). Finally, the loss of positive charge at physiological pH caused by citrullination can be utilized. Prior to bottom up proteomics analysis, proteins are enzymatically cleaved into peptides. Commonly the protease trypsin is used, which cleaves after the positively charged arginine and lysine residues. However, trypsin is unable to cleave after a citrulline residue which is neutral. A missed cleavage after a citrulline residue together with the correct mass shift can be used as a specific and sensitive marker for citrullination, and the strategy is compatible with standard bottom up proteomics workflows.