Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ) и инъекция круглых сперматид (РОСИ)

Введение

Процедура экстракорпорального оплодотворения

Интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ '/ɪ//k//s//i/ IKsee) – это процедура экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), при которой один сперматозоид вводится непосредственно в цитоплазму яйцеклетки. Эта техника используется для подготовки гамет к получению эмбрионов, которые могут быть перенесены в матку. При этом методе акросомная реакция не требуется. Существуют несколько различий между классическим ЭКО и ИКСИ. Однако, этапы, которые необходимо выполнить до и после инсеминации, остаются одинаковыми. Что касается самой инсеминации, для ИКСИ требуется всего один сперматозоид на яйцеклетку, в то время как для ЭКО необходимо 50 000–100 000. Это объясняется тем, что акросомная реакция должна произойти, и для ЭКО требуется участие тысяч сперматозоидов. После оплодотворения яйцеклетка превращается в преэмбрион, который необходимо перенести в матку для продолжения его развития. Первая в мире беременность, полученная с помощью ИКСИ, была осуществлена в 1991 году Джанпьеро Палермо и его командой.

Инъекция сперматозоидов (ROSI)

Инъекция круглых сперматид (ROSI) – это метод вспомогательных репродуктивных технологий, при котором круглый сперматид вводится в цитоплазму яйцеклетки для достижения оплодотворения. Этот метод может быть использован для обеспечения генетического отцовства мужчинам, у которых в эякуляте отсутствуют сперматозоиды (азооспермия) и у которых невозможно получить сперматозоиды хирургическим путем из яичек. Это состояние называется необструктивной или секреторной азооспермией, в отличие от обструктивной азооспермии, при которой в яичках происходит полноценное производство спермы, и потенциально оплодотворяющие сперматозоиды могут быть получены путем экстракции спермы из яичек (TESE) и использованы для ИКСИ. В случае необструктивной (секреторной) азооспермии производство спермы в яичках блокируется на различных стадиях процесса сперматогенеза (образования спермы). У мужчин, у которых сперматогенез блокируется на стадии круглых сперматид, после завершения мейоза, эти круглые клетки могут успешно оплодотворить яйцеклетки после инъекции в их цитоплазму. Несмотря на то, что многие технические аспекты ROSI схожи с ИКСИ, между этими двумя методами существуют значительные различия. Во-первых, по сравнению со сперматозоидами, круглые сперматиды не имеют четко выраженных морфологических характеристик и неподвижны. Следовательно, отличить круглые сперматиды от других клеток круглой формы аналогичного размера, таких как лейкоциты, не всегда легко. Кроме того, для различения живых круглых сперматид, предназначенных для использования в ROSI, и мертвых, подлежащих отбраковке, требуются специальные методы и навыки, которые не нужны при ИКСИ, где жизнеспособность сперматозоидов в большинстве случаев можно легко оценить по их подвижности. Клинический потенциал ROSI в лечении мужского бесплодия, вызванного полным отсутствием сперматозоидов, был недавно подтвержден публикацией, сообщающей о послеродовом развитии 90 детей, рожденных в Японии, и 17 – в Испании. Оценка этих детей не выявила каких-либо аномалий, связанных с методом ROSI. Его можно использовать при тератозооспермии, поскольку после оплодотворения яйцеклетки аномальная морфология сперматозоидов, по-видимому, не влияет на развитие или морфологию бластоцист. Даже при тяжелой тератозооспермии микроскопия все еще может обнаружить небольшое количество сперматозоидов с «нормальной» морфологией, что позволяет добиться оптимальных результатов. Другой способ отбора – метод MACS, который заключается в использовании крошечных магнитных частиц, связанных с антителом (аннексином V), способным идентифицировать более жизнеспособные сперматозоиды. При прохождении образца спермы через колонку с магнитным полем апоптотические сперматозоиды задерживаются в колонке, а здоровые легко извлекаются снизу. PICSI – еще один метод, основанный на этом принципе, единственное отличие заключается в процессе отбора сперматозоидов. В этом случае их помещают на чашку Петри, содержащую капли синтетического соединения, похожего на гиалуроновую кислоту. Мы можем определить зрелые сперматозоиды по их способности связываться с каплями ГК. Это связано с тем, что только зрелые сперматозоиды имеют рецептор к гиалуроновой кислоте, необходимый им, поскольку эта кислота окружает яйцеклетки, и сперматозоидам необходимо связываться с ней и расщеплять ее для оплодотворения яйцеклетки. После отбора зрелых сперматозоидов их можно использовать для микроинъекции яйцеклеток. Отбор сперматозоидов с помощью гиалуроновой кислоты практически не влияет на вероятность наступления живорождения, но может снизить риск выкидышей.

Round spermatid injection (ROSI) is a technique of assisted reproduction whereby a round spermatid is injected into oocyte cytoplasm in order to achieve fertilization. This technique can be used to enable genetic fatherhood to some men who have no spermatozoa in the ejaculate (azoospermia) and in whom spermatozoa cannot be obtained surgically from the testicles. This condition is called non obstructive or secretory azoospermia, as opposed to obstructive azoospermia, in which complete sperm production does occur in the testicles, and potentially fertilizing spermatozoa can be obtained by testicular sperm extraction (TESE) and used for ICSI. In cases of nonobstructive (secretory) azoospermia, on the other hand, testicular sperm production is blocked at different stages of the process of sperm formation (spermatogenesis). In those men in whom spermatogenesis is blocked at the stage of round spermatids, in which meiosis has already been completed, these round cells can successfully fertilize oocytes after being injected into their cytoplasm. Even though many technical aspects of ROSI are similar to those of ICSI, there are also significant differences between both techniques. In the first place, as compared to spermatozoa, round spermatids do not possess easily perceptible morphological characteristics and are immotile. Consequently, the distinction between round spermatids and other round cells of similar size, such as leukocytes, is not an easy task. Moreover, the distinction between living round spermatids, to be used in ROSI, and dead round spermatids, to be discarded, needs specific methods and skills, not required in the case of ICSI where sperm cell viability can be easily evaluated on the basis of sperm motility in most cases. The clinical potential of ROSI in the treatment of male infertility due to the total absence of spermatozoa has been corroborated recently by a publication reporting on the postnatal development of 90 babies born in Japan and 17 in Spain. Based on the evaluation of the babies born, no abnormalities attributable to the ROSI technique have been identified. It can be used in teratozoospermia, because once the egg is fertilized, abnormal sperm morphology does not appear to influence blastocyst development or blastocyst morphology. Even with severe teratozoospermia, microscopy can still detect the few sperm cells that have a "normal" morphology, allowing for optimal success rate. Another way to perform the selection is the MACS technique, which consists of tiny magnetic particles linked to an antibody (annexin V) which is able to identify more viable spermatozoa. When the semen sample is passed through a column with a magnetic field, apoptotic respermatozoa are retained in the column while the healthy ones are easily obtained at the bottom of it. PICSI is another method derived from this one, the only difference is the selection process of the spermatozoa. In this case, they are placed on a plate containing drops of a synthetic compound similar to hyaluronic acid. We will know which spermatozoa are mature because they will bind to the HA drops. This is because only mature sperm have a receptor for hyaluronic acid, which they need because this acid can be found surrounding the oocytes, and sperm need to be able to bind to this acid and digest it in order to fertilize the oocyte. After the mature spermatozoa have been selected, they can be used for the microinjection of oocytes. Sperms selected by hyaluronic acid has about no effect on whether a live birth results, but may reduce miscarriage.

История

Первым ребенком, родившимся в результате микроманипуляции гамет (техника, в которой используются специальные инструменты и инвертированные микроскопы, помогающие эмбриологам выбирать и отбирать отдельные сперматозоиды для ИКСИ-ЭКО, стал ребенок, родившийся в Сингапуре в апреле 1989 года. Техника была разработана Джанпьеро Палермо в Свободном университете Брюсселя в Центре репродуктивной медицины под руководством Пола Деврои и Андре Ван Стиртегема. Фактически, открытие было сделано случайно. Сама процедура была впервые выполнена в 1987 году, однако развитие эмбриона остановилось на стадии ядра. Первый активированный эмбрион, полученный с помощью ИКСИ, был создан в 1990 году, но первые успешные роды после ИКСИ произошли 14 января 1992 года после зачатия в апреле 1991 года. Шарп и другие отмечают успех ИКСИ с 1992 года, говоря: «Таким образом, женщина несет основное бремя лечения мужского бесплодия, что является довольно уникальным сценарием в медицинской практике. Успех ИКСИ фактически отвлек внимание от выявления причин мужского бесплодия и перенаправил исследования на женщину, чтобы оптимизировать получение яйцеклеток и восприимчивость эндометрия, от которых зависит успех ИКСИ».

Процедура

ИКСИ обычно проводится после процедуры трансвагинальной пункции фолликулов для извлечения одного или нескольких ооцитов у женщины. При ИКСИ-ЭКО мужчина или донор предоставляет образец спермы в тот же день, когда собирают яйцеклетки. Образец проверяется в лаборатории, и если сперма отсутствует, врачи извлекают сперматозоиды из придатка яичка или непосредственно из яичка. Извлечение сперматозоидов из придатка яичка также известно как перкутанная эпидидимальная аспирация спермы (PESA), а извлечение сперматозоидов из яичка – как аспирация сперматозоидов из яичка (TESA). В зависимости от общего количества сперматозоидов в образце спермы – низкого или высокого – его можно просто промыть или активировать (capacitate) с помощью метода «swim-up» или градиентного центрифугирования, соответственно. Процедура выполняется под микроскопом с использованием нескольких устройств микроманипуляции (микроманипулятор, микроинжектор и микропипетки). Пипетка-держатель стабилизирует зрелый ооцит с помощью мягкого всасывания, создаваемого микроинжектором. С противоположной стороны тонкая, полая стеклянная микропипетка используется для захвата одного сперматозоида после его иммобилизации путем перерезания хвоста кончиком микропипетки. Ооцит проникается через оолемму, и сперматозоид направляется во внутреннюю часть ооцита (цитоплазму). Затем сперматозоид высвобождается в ооцит. На изображении представленный ооцит имеет экструдированное полярное тельце примерно в положении «12 часов», что указывает на его зрелость. Полярное тельце располагается в положении «12» или «6 часов», чтобы гарантировать, что вводимая микропипетка не повредит веретено деления внутри яйцеклетки. После процедуры ооцит помещается в клеточную культуру и на следующий день проверяется на признаки оплодотворения. В отличие от этого, при естественном оплодотворении сперматозоиды конкурируют, и когда первый сперматозоид проникает в оолемму, она затвердевает, блокируя проникновение других сперматозоидов. Высказывались опасения, что при ИКСИ этот процесс отбора сперматозоидов обходится, и сперматозоид отбирается эмбриологом без специального тестирования. Однако в середине 2006 года FDA одобрило устройство, позволяющее эмбриологам отбирать зрелые сперматозоиды для ИКСИ на основе их связывания с гиалуроновой кислотой – основным компонентом гелеобразного слоя (cumulus oophorus), окружающего ооцит. Устройство обеспечивает микроскопические капли гидрогеля гиалуроновой кислоты, прикрепленные к чашке Петри. Эмбриолог помещает подготовленный сперматозоид на микрокаплю, выбирает и захватывает сперматозоиды, которые связываются с ней. Базовые исследования созревания сперматозоидов показывают, что сперматозоиды, связывающие гиалуроновую кислоту, более зрелые и имеют меньше повреждений ДНК и значительно более низкий уровень анеуплоидии, чем популяция сперматозоидов, из которой они были отобраны. Одним из таких устройств для отбора сперматозоидов является PICSI. Недавнее клиническое исследование показало значительное снижение частоты выкидышей у эмбрионов, полученных с использованием отбора сперматозоидов PICSI. В процессе может использоваться «промытая» или «непромытая» сперма. Показатель живорождений значительно выше при использовании прогестерона для поддержки имплантации в циклах ИКСИ. Кроме того, добавление агониста ГнРГ, по оценкам, повышает показатели успеха. Ультравысокоувеличенная инъекция сперматозоидов (IMSI) не демонстрирует повышения частоты живорождений или выкидышей по сравнению со стандартной ИКСИ. Новая вариация стандартной процедуры ИКСИ, называемая Piezo ICSI, использует небольшие осевые механические импульсы (Piezo-импульсы) для снижения нагрузки на цитоскелет во время прокола зоны пеллюциды и оолеммы. Процедура включает в себя специализированные пьезоактуаторы, микрокапилляры и питательную среду для передачи механических импульсов к клеточным мембранам. Сама техника Piezo, например, была разработана для ИКСИ животных и переноса ES-клеток животных.

ICSI is generally performed following a transvaginal oocyte retrieval procedure to extract one or several oocytes from a woman. In ICSI IVF, the male partner or a donor provides a sperm sample on the same day when the eggs are collected. The sample is checked in the lab, and if no sperm is present, doctors will extract sperm from the epididymis or testicle. The extraction of sperm from epididymis is also known as percutaneous epididymal sperm aspiration (PESA) and extraction of sperm from testicle is also known as testicular sperm aspiration (TESA). Depending on the total amount of spermatozoa in the semen sample, either low or high, it can be just washed or capacitated via swim up or gradients, respectively. The procedure is done under a microscope using multiple micromanipulation devices (micromanipulator, microinjectors and micropipettes). A holding pipette stabilizes the mature oocyte with gentle suction applied by a microinjector. From the opposite side a thin, hollow glass micropipette is used to collect a single sperm, having immobilised it by cutting its tail with the point of the micropipette. The oocyte is pierced through the oolemma and the sperm is directed into the inner part of the oocyte (cytoplasm). The sperm is then released into the oocyte. The pictured oocyte has an extruded polar body at about 12 o'clock indicating its maturity. The polar body is positioned at the 12 or 6 o'clock position, to ensure that the inserted micropipette does not disrupt the spindle inside the egg. After the procedure, the oocyte will be placed into cell culture and checked on the following day for signs of fertilization. In contrast, in natural fertilization sperm compete and when the first sperm penetrates the oolemma, the oolemma hardens to block the entry of any other sperm. Concern has been raised that in ICSI this sperm selection process is bypassed and the sperm is selected by the embryologist without any specific testing. However, in mid 2006 the FDA cleared a device that allows embryologists to select mature sperm for ICSI based on sperm binding to hyaluronan, the main constituent of the gel layer (cumulus oophorus) surrounding the oocyte. The device provides microscopic droplets of hyaluronan hydrogel attached to the culture dish. The embryologist places the prepared sperm on the microdot, selects and captures sperm that bind to the dot. Basic research on the maturation of sperm shows that hyaluronan binding sperm are more mature and show fewer DNA strand breaks and significantly lower levels of aneuploidy than the sperm population from which they were selected. A brand name for one such sperm selection device is PICSI. A recent clinical trial showed a sharp reduction in miscarriage with embryos derived from PICSI sperm selection. 'Washed' or 'unwashed' sperm may be used in the process. Live birth rate are significantly higher with progesterone to assist implantation in ICSI cycles. Also, addition of a GNRH agonist has been estimated to increase success rates. Ultra high magnification sperm injection (IMSI) has no evidence of increased live birth or miscarriage rates compared to standard ICSI. A new variation of the standard ICSI procedure called Piezo ICSI uses small axial mechanical pulses (Piezo pulses) to lower stress to the cytoskeleton during zona pellucida and oolemma breakage. The procedure includes specialized Piezo actuators, microcapillaries, and filling medium to transfer mechanical pulses to the cell membranes. The Piezo technique itself was for example established for animal ICSI and animal ES cell transfer.

Помощь при вылуплении из зон (AH)

Люди, у которых неоднократно были неудачные попытки имплантации, или у эмбриона которых наблюдается утолщенная оболочка (zona pellucida), являются идеальными кандидатами для ассистированного вылупления. Процедура заключается в создании отверстия в оболочке, чтобы увеличить вероятность нормальной имплантации эмбриона в матку.

Преимплантационная генетическая диагностика (ПГД)

ПГД – это процедура, при которой из эмбриона на 3-й или 5-й день извлекается одна или две клетки для генетического анализа. Пары с высоким риском рождения ребенка с аномальным числом хромосом или имеющие в анамнезе одногенные или хромосомные дефекты являются идеальными кандидатами для этой процедуры. В настоящее время она используется для диагностики широкого спектра генетических дефектов.

Факторы успеха или неудачи

Одной из областей, в которой инъекция сперматозоидов может быть полезна, является восстановление проходимости семявыносящих протоков после вазэктомии. Однако, на частоту наступления беременности (и родов) при ИКСИ могут влиять такие факторы, как степень фрагментации ДНК, определяемая, например, методом «комета», возраст матери и качество спермы. Неясно, повышает ли ИКСИ частоту родов или снижает риск выкидыша по сравнению с отбором сперматозоидов при ультравысоком увеличении (ИМСИ). Систематический метаанализ 24 оценок повреждения ДНК, основанный на различных методиках, показал, что повреждение ДНК сперматозоидов негативно сказывается на наступлении клинической беременности после ИКСИ. Многочисленные биохимические маркеры были показаны связанными с качеством ооцитов при ИКСИ. Например, было установлено, что после ИКСИ фолликулярная жидкость неоплодотворенных ооцитов содержит повышенный уровень цитотоксичности и маркеров окислительного стресса, таких как Cu,Zn-супероксиддисмутаза, каталаза и конъюгаты белка с 4-гидроксиноненалом (4 HNE) – продуктом липопероксидации.

Осложнения

Существует некоторое мнение о том, что использование ЭКО в целом, и ИКСИ в частности, может быть связано с повышенным риском врожденных дефектов, хотя результаты различных исследований противоречивы. В сводном документе о позиции, Комитет практики Американского общества репродуктивной медицины заявил, что считает ИКСИ безопасным и эффективным методом лечения мужского фактора бесплодия, однако он может нести повышенный риск передачи определенных генетических аномалий потомству, либо непосредственно в ходе процедуры, либо из-за повышенного риска таких аномалий у родителей, обращающихся за данной процедурой. Недостаточно данных, чтобы утверждать, что процедуры ИКСИ безопасны для женщин с гепатитом В в отношении вертикальной передачи инфекции потомству, поскольку прокол яйцеклетки потенциально может способствовать такой передаче.

Последующая проверка плода

В дополнение к стандартному ведению беременности, уместен пренатальный скрининг на анеуплоидии, основанный на возрасте матери, измерении толщины нухальной складки и биомаркерах. Однако, биомаркеры, по всей видимости, изменяются в беременностях, полученных в результате ИКСИ, что приводит к более высокой частоте ложноположительных результатов. Разработаны корректирующие коэффициенты, которые следует использовать при скрининге на синдром Дауна в одноплодных беременностях после ИКСИ, но для многоплодных беременностей такие коэффициенты не были полностью установлены. В случаях замирания одной из двойни с наличием второго гестационного мешка с нежизнеспособным плодом, скрининг первого триместра должен основываться исключительно на возрасте матери и измерении толщины нухальной складки, поскольку в этих случаях биомаркеры значительно изменены.