Введение
Количество вируса, обнаруженного в ткани хозяина
Вирусная нагрузка, также известная как вирусный титр, является числовым выражением количества вируса в заданном объеме жидкости, включая биологические и образцы окружающей среды. Ее не следует путать с вирусным титром (viral titre/titer), который зависит от метода анализа. При проведении анализа для измерения инфекционных вирусных частиц (например, анализ на бляшки, анализ на фокусы), вирусный титр часто относится к концентрации инфекционных вирусных частиц, что отличается от общего количества вирусных частиц. Вирусная нагрузка измеряется в таких биологических жидкостях, как мокрота и плазма крови. Норовирус характеризуется не только длительным выделением вируса и способностью выживать в окружающей среде, но и крайне низкой инфекционной дозой, необходимой для заражения человека: менее 100 вирусных частиц. Вирусная нагрузка часто выражается в вирусных частицах (вирионах) или инфекционных частицах на миллилитр, в зависимости от типа анализа. Более высокая вирусная нагрузка, титр или вирусный титр часто коррелирует с тяжестью активной вирусной инфекции. Количество вируса на миллилитр можно рассчитать, оценив количество жизнеспособного вируса в исследуемой жидкости. Например, результат может быть представлен в копиях РНК на миллилитр плазмы крови. Мониторинг вирусной нагрузки используется для контроля терапии при хронических вирусных инфекциях, а также у пациентов с ослабленным иммунитетом, например, восстанавливающихся после трансплантации костного мозга или органов. В настоящее время доступны рутинные тесты для определения вируса иммунодефицита человека 1 типа (ВИЧ-1), цитомегаловируса, вируса гепатита B и вируса гепатита C. Мониторинг вирусной нагрузки при ВИЧ имеет особое значение в лечении ВИЧ-инфицированных, поскольку этот вопрос постоянно обсуждается в контексте ведения ВИЧ/СПИДа. Неопределяемая вирусная нагрузка не свидетельствует об отсутствии инфекции. ВИЧ-положительные пациенты, получающие длительную комбинированную антиретровирусную терапию, могут демонстрировать неопределяемую вирусную нагрузку в большинстве клинических анализов, поскольку концентрация вирусных частиц находится ниже предела обнаружения (LOD).
Технологии тестирования вирусной нагрузки
Обзорное исследование 2010 года, проведенное Puren и соавторами, классифицирует тестирование вирусной нагрузки на три типа: (1) тесты, основанные на амплификации нуклеиновых кислот (НАТ или НААТ), коммерчески доступные в Соединенных Штатах с одобрением Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) или представленные на рынке в Европейской экономической зоне (ЕЭЗ) с CE-маркировкой; (2) разработанные самостоятельно или внутрилабораторные НАТ; (3) тесты, не основанные на нуклеиновых кислотах.
Испытания на основе нуклеиновой кислоты (НАТ)
Существует множество различных молекулярно-генетических методов для количественного определения вирусной нагрузки с использованием NAT. Исходный материал для амплификации позволяет разделить эти молекулярные методы на три группы:
Усиление мишени, использующее саму нуклеиновую кислоту. Некоторые из наиболее распространенных методов:
Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – метод in vitro синтеза ДНК, использующий матрицу ДНК, полимеразу, буферы, праймеры и нуклеотиды для размножения ВИЧ в образце крови. Затем химическая реакция маркирует вирус. Маркеры измеряются и используются для расчета количества вируса. ПЦР используется для количественного определения интегрированной ДНК. Обратная транскрипция полимеразной цепной реакции (RT-ПЦР) является вариантом ПЦР, который может использоваться для количественного определения вирусной РНК. РНК используется в качестве исходного материала для этого метода и преобразуется в двухцепочечную ДНК с использованием фермента обратной транскриптазы (RT) для ПЦР. Метод амплификации на основе нуклеиновой кислоты (NASBA) является вариантом ПЦР, основанным на системе амплификации транскрипции (TAS). РНК используется в качестве мишени, и создается копия ДНК. Копия ДНК затем транскрибируется в РНК и амплифицируется. Существует несколько коммерческих вариантов TAS, включая транскрипционно-опосредованную амплификацию (TMA) и самоподдерживающуюся репликацию последовательностей (3SR). Усиление с использованием специфических зондов использует синтетические зонды, которые предпочтительно связываются с целевой последовательностью. Затем зонды амплифицируются.
Усиление сигнала использует большое количество сигнала, связанного с неусиленной мишенью, изначально присутствующей в образце. Один из наиболее часто используемых методов:
Метод разветвленной ДНК (bDNA) может использовать ДНК или РНК в качестве целевой нуклеиновой кислоты. Короткие зонды, прикрепленные к твердой подложке, захватывают целевую нуклеиновую кислоту. Дополнительные зонды-удлинители также связываются с целевой нуклеиновой кислотой и с многочисленными репортерными молекулами, которые используются для увеличения интенсивности сигнала, который преобразуется в вирусную нагрузку.
Target amplification which uses the nucleic acid itself. Just a few of the more common methods
The polymerase chain reaction (PCR) method of in vitro DNA synthesis uses a DNA template, polymerase, buffers, primers, and nucleotides to multiply the HIV in the blood sample. Then a chemical reaction marks the virus. The markers are measured and used to calculate the amount of virus. PCR is used to quantify integrated DNA. Reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR) is a variation of PCR that can be used to quantify viral RNA. RNA is used as the starting material for this method and converted to double stranded DNA, using the enzyme reverse transcriptase (RT) for PCR. The nucleic acid sequence based amplification (NASBA) method is a transcription based amplification system (TAS) variation of PCR. RNA is used as the target and a DNA copy is made. The DNA copy is then transcribed into RNA and amplified. Several TAS commercial variations are available including; transcription mediated amplification (TMA), and self sustaining sequence replication (3SR). Probe specific amplification uses synthetic probes that preferentially bind to a target sequence. The probes are then amplified
Signal amplification uses large amounts of signal bound to an unamplified target originally present in the sample. One commonly used method:
The branched DNA (bDNA) method can use either DNA or RNA as the target nucleic acid. Short probes attached to a solid support and capture the target nucleic acid. Additional extender probes also bind to the target nucleic acid and to numerous reporter molecules which are used to increase the signal intensity, which is converted to a viral count.
Образцы плазмы
Плазма ЭДТА, полученная из образца крови с ЭДТА, является хорошим источником вирусной РНК, свободной от клеток, для определения вирусной нагрузки методом ПЦР. Выделение РНК из плазмы требует специализированного оборудования, реагентов и обучения, что может быть недоступно для лабораторий среднего и малого размера. Требуется большой объем образца (> 1 мл плазмы), для получения которого необходима венопункция.
Хранение
Кровь, собранная в EDTA, может храниться при комнатной температуре в течение 30 часов, а отделённая плазма – в течение длительного времени при 70 °C без существенного снижения вирусной нагрузки.
Измерение
Вирусная нагрузка измеряется в копиях РНК ВИЧ на миллилитр (мл) крови. Изменения вирусной нагрузки обычно выражаются в логарифмических единицах (в степенях 10). Например, увеличение вирусной нагрузки на три логарифма (3 log10) означает увеличение в 103, или в 1000 раз по сравнению с предыдущим уровнем, а снижение с 500 000 до 500 копий – это снижение на три логарифма (также 3 log10).
Другие факторы, влияющие на вирусную нагрузку
Различные методы тестирования часто дают разные результаты для одного и того же образца пациента. Чтобы результаты были сопоставимы, необходимо использовать один и тот же метод (усиление мишени, амплификация с использованием специфических зондов или усиление сигнала) каждый раз при исследовании образца пациента. В идеале, тестирование пациентов должно проводиться в одной и той же медицинской лаборатории, с использованием одного и того же теста для определения вирусной нагрузки и одного и того же анализатора.