Вирус гепатита C: структура и особенности генома.

Введение

Вид вируса
Вирус гепатита С (ВГС) — это небольшой (55–65 нм в диаметре), заключенный в оболочку, одноцепочечный РНК-вирус положительной полярности из семейства Flaviviridae. Вирус гепатита С является причиной гепатита С, а также некоторых онкологических заболеваний, таких как рак печени (гепатоцеллюлярная карцинома, сокращенно ГЦК) и лимфомы у людей.

Таксономия

Вирус гепатита С относится к роду Hepacivirus, входящему в семейство Flaviviridae. До 2011 года он считался единственным представителем этого рода. Однако вирус этого рода был обнаружен у собак: собачий гепацивирус. Также известен по крайней мере один вирус этого рода, инфицирующий лошадей. Несколько дополнительных вирусов рода были описаны у летучих мышей и грызунов.

Структура

Частица вируса гепатита С состоит из липидной мембранной оболочки диаметром 55–65 нм. Два вирусных оболочечных гликопротеина, E1 и E2, внедрены в липидную оболочку. Они участвуют в прикреплении вируса к клетке и проникновении в неё. HVR1 помогает E2 маскировать вирус от иммунной системы, препятствуя связыванию CD81 с соответствующим рецептором на поверхности вируса.

Геном

Вирус гепатита С имеет одноцепочечный РНК-геном положительной полярности. Геном состоит из одной открытой рамки считывания длиной 9600 нуклеотидных оснований. Эта единственная открытая рамка считывания транслируется в один белковый продукт, который затем подвергается дальнейшей обработке с образованием более мелких активных белков. Именно поэтому в общедоступных базах данных, таких как Европейский институт биоинформатики, вирусный протеом состоит только из двух белков. На 5'- и 3'- концах РНК расположены нетранслируемые области (UTR), которые не транслируются в белки, но играют важную роль в трансляции и репликации вирусной РНК. 5'-UTR содержит сайт связывания рибосомы или внутренний сайт инициации трансляции (IRES), который инициирует трансляцию очень длинного белка, содержащего около 3000 аминокислот. Основной домен IRES вируса гепатита С содержит четырехспиральный стыковой узел Холлидея, встроенный в предсказанный псевдоузел. Конформация этого основного домена ограничивает ориентацию открытой рамки считывания для позиционирования на 40S-рибосомальной субъединице. Большой предшественник белка впоследствии расщепляется клеточными и вирусными протеазами на 10 меньших белков, которые обеспечивают вирусную репликацию внутри клетки-хозяина или сборку в зрелые вирусные частицы. Структурные белки, производимые вирусом гепатита С, включают белок ядра, E1 и E2; неструктурные белки включают NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B.

Молекулярная биология

Белки этого вируса расположены вдоль генома в следующем порядке: N-концевая оболочка ядра (E1)–E2–p7 неструктурный белок 2 (NS2)–NS3–NS4A–NS4B–NS5A–NS5B–C-концевая область. Появление зрелых неструктурных белков (от NS2 до NS5B) зависит от активности вирусных протеиназ. Стыковка NS2/NS3 расщепляется металлозависимой автокаталитической протеиназой, кодируемой в пределах NS2 и N-конца NS3. Остальные расщепления ниже по течению от этого участка катализируются серин-протеазой, также содержащейся в N-концевой области NS3. Ядро белка содержит 191 аминокислоту и может быть разделено на три домена на основе гидрофобности: домен 1 (остатки 1–117) содержит в основном основные остатки с двумя короткими гидрофобными областями; домен 2 (остатки 118–174) менее основной и более гидрофобный, а его C-конец находится в конце p21; домен 3 (остатки 175–191) является высокогидрофобным и действует как сигнальная последовательность для белка оболочки E1. Оба белка оболочки (E1 и E2) сильно гликозилированы и важны для проникновения в клетку. E1 служит фузогенной субъединицей, а E2 действует как белок, связывающий рецептор. E1 имеет 4–5 N-связанных гликанов, а E2 имеет 11 N-гликозилирующих участков. Белок NS1 (p7) не является необходимым для репликации вирусного генома, но играет критическую роль в морфогенезе вируса. Этот белок представляет собой 63 аминокислотный мембранный белок, который локализуется в эндоплазматическом ретикулуме. Расщепление p7 опосредовано сигнальными пептидазами эндоплазматического ретикулума. Два трансмембранных домена p7 соединены цитоплазматической петлей и ориентированы к просвету эндоплазматического ретикулума. Белок NS2 представляет собой 21–23 килодальтонный (kDa) трансмембранный белок с протеазной активностью. NS3 представляет собой 67 kDa белок, N-конец которого обладает активностью серин-протеазы, а C-конец – активностью NTPазы/геликазы. Он локализуется в эндоплазматическом ретикулуме и образует гетеродимерный комплекс с NS4A – 54 аминокислотным мембранным белком, который действует как кофактор протеиназы. NS4A – 54 аминокислотный мембранный белок, который действует как кофактор протеиназы. NS4B – это небольшой (27 kDa) гидрофобный интегральный мембранный белок с четырьмя трансмембранными доменами. Он локализуется в эндоплазматическом ретикулуме и играет важную роль в рекрутировании других вирусных белков. Он индуцирует морфологические изменения в эндоплазматическом ретикулуме, формируя структуру, называемую мембранной сетью. NS5A – это гидрофильный фосфопротеин, который играет важную роль в репликации вируса, модуляции клеточных сигнальных путей и интерфероновом ответе. Известно, что он связывается с эндоплазматическими белками VAP человека, закрепленными в ретикулуме. Белок NS5B (65 kDa) является вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразой. NS5B выполняет ключевую функцию репликации вирусной РНК ВГС, используя вирусную РНК с положительным смыслом в качестве матрицы и катализируя полимеризацию трифосфатов рибонуклеозидов (rNTP) во время репликации РНК. Несколько кристаллических структур NS5B полимеразы в различных кристаллических формах были определены на основе той же консенсусной последовательности BK (HCV BK, генотип 1). Структуру можно представить в виде правой руки с пальцами, ладонью и большим пальцем. Окруженный активный центр, уникальный для NS5B, содержится в структуре ладони белка. Недавние исследования структуры белка NS5B генотипа 1b штамма J4 (HC J4) указывают на наличие активного центра, где возможен контроль связывания нуклеотидов и инициирование de novo синтеза РНК. De novo добавляет необходимые праймеры для инициирования репликации РНК. Текущие исследования направлены на связывание структур с этим активным центром, чтобы изменить его функциональность и предотвратить дальнейшую репликацию вирусной РНК. Также был описан одиннадцатый белок. Этот белок кодируется сдвигом рамки считывания +1 в гене капсида. Он, по-видимому, является антигенным, но его функция неизвестна.

The proteins of this virus are arranged along the genome in the following order: N terminal core envelope (E1)–E2–p7 nonstructural protein 2 (NS2)–NS3–NS4A–NS4B–NS5A–NS5B–C terminal. The mature nonstructural proteins (NS2 to NS5B) generation relies on the activity of viral proteinases. The NS2/NS3 junction is cleaved by a metal dependent autocatalytic proteinase encoded within NS2 and the N terminus of NS3. The remaining cleavages downstream from this site are catalysed by a serine protease also contained within the N terminal region of NS3. The core protein has 191 amino acids and can be divided into three domains on the basis of hydrophobicity: domain 1 (residues 1–117) contains mainly basic residues with two short hydrophobic regions; domain 2 (residues 118–174) is less basic and more hydrophobic and its C terminus is at the end of p21; domain 3 (residues 175–191) is highly hydrophobic and acts as a signal sequence for E1 envelope protein. Both envelope proteins (E1 and E2) are highly glycosylated and important in cell entry. E1 serves as the fusogenic subunit and E2 acts as the receptor binding protein. E1 has 4–5 N linked glycans and E2 has 11 N glycosylation sites. NS1 (p7) protein is dispensable for viral genome replication but plays a critical role in virus morphogenesis. This protein is a 63 amino acid membrane spanning protein which locates itself in the endoplasmic reticulum. Cleavage of p7 is mediated by the endoplasmic reticulum's signal peptidases. Two transmembrane domains of p7 are connected by a cytoplasmic loop and are oriented towards the endoplasmic reticulum's lumen. NS2 protein is a 21–23 kilodalton (kDa) transmembrane protein with protease activity. NS3 is 67 kDa protein whose N terminal has serine protease activity and whose C terminal has NTPase/helicase activity. It is located within the endoplasmic reticulum and forms a heterodimeric complex with NS4A—a 54 amino acid membrane protein that acts as a cofactor of the proteinase. NS4A—a 54 amino acid membrane protein that acts as a cofactor of the proteinase. NS4B is a small (27 kDa) hydrophobic integral membrane protein with four transmembrane domains. It is located within the endoplasmic reticulum and plays an important role for recruitment of other viral proteins. It induces morphological changes to the endoplasmic reticulum forming a structure termed the membranous web. NS5A is a hydrophilic phosphoprotein which plays an important role in viral replication, modulation of cell signaling pathways and the interferon response. It is known to bind to endoplasmic reticulum anchored human VAP proteins. The NS5B protein (65 kDa) is the viral RNA dependent RNA polymerase. NS5B has the key function of replicating the HCV's viral RNA by using the viral positive sense RNA strand as its template and catalyzes the polymerization of ribonucleoside triphosphates (rNTP) during RNA replication. Several crystal structures of NS5B polymerase in several crystalline forms have been determined based on the same consensus sequence BK (HCV BK, genotype 1). The structure can be represented by a right hand shape with fingers, palm, and thumb. The encircled active site, unique to NS5B, is contained within the palm structure of the protein. Recent studies on NS5B protein genotype 1b strain J4's (HC J4) structure indicate a presence of an active site where possible control of nucleotide binding occurs and initiation of de novo RNA synthesis. De novo adds necessary primers for initiation of RNA replication. Current research attempts to bind structures to this active site to alter its functionality in order to prevent further viral RNA replication. An 11th protein has also been described. This protein is encoded by a +1 frameshift in the capsid gene. It appears to be antigenic but its function is unknown.

Репликация

Репликация ВГС включает несколько этапов. Вирус реплицируется преимущественно в гепатоцитах печени, где, по оценкам, ежедневно каждая инфицированная клетка производит около пятидесяти вирионов (вирусных частиц), в общей сложности генерируя один триллион вирионов. Вирус также может реплицироваться в мононуклеарных клетках периферической крови, что потенциально объясняет высокий уровень иммунологических нарушений, наблюдаемых у пациентов с хронической инфекцией ВГС. В печени вирусные частицы ВГС попадают в печеночные синусоиды с кровотоком. Эти синусоиды расположены вблизи гепатоцитов. Проникновение в клетки-хозяева происходит посредством сложных взаимодействий между вирионами, особенно через их гликопротеины, и молекулами клеточной поверхности CD81, рецептором LDL, SR BI, DC SIGN, Claudin 1 и Occludin. Оболочка ВГС структурно сходна с липопротеинами очень низкой плотности (VLDL) и липопротеинами низкой плотности (LDL). Геном ВГС транслируется с образованием единого полипротеина, состоящего примерно из 3011 аминокислот. Полипротеин затем подвергается протеолитическому расщеплению вирусными и клеточными протеазами, в результате чего образуются три структурных (ассоциированных с вирионом) и семь неструктурных (НС) белков. Альтернативно, в области структурного белка Core может произойти сдвиг рамки считывания, приводящий к образованию белка с альтернативной рамкой считывания (ARFP). ВГС кодирует две протеазы: NS2 цистеиновую автопротеазу и NS3 4A сериновую протеазу. Затем НС-белки рекрутируют вирусный геном в комплекс репликации РНК, который связан с перестроенными цитоплазматическими мембранами. Репликация РНК осуществляется с помощью вирусной РНК-зависимой РНК-полимеразы NS5B, которая производит промежуточную отрицательную цепь РНК. Отрицательная цепь РНК затем служит матрицей для синтеза новых положительных вирусных геномов. Образовавшиеся геномы могут быть транслированы, дополнительно реплицированы или упакованы в новые вирусные частицы. Вирус реплицируется на внутриклеточных липидных мембранах. Эндоплазматический ретикулум, в частности, деформируется, образуя уникальные по форме мембранные структуры, называемые «мембранными сетями». Эти структуры могут индуцироваться одной лишь экспрессией вирусного белка NS4B. Структурный белок Core ассоциируется с липидными каплями и использует микротрубочки и динеины для изменения их локализации в перинуклеарной области. Выход из гепатоцита может происходить по пути секреции VLDL. Другая гипотеза предполагает, что вирусные частицы могут выделяться из эндоплазматического ретикулума через эндосомальный сортировочный комплекс, необходимый для транспорта (ESCRT). Подтипы далее подразделяются на квазивиды на основе их генетического разнообразия. Генотипы различаются на 30–35% нуклеотидных позиций по всему геному. Различия в геномном составе подтипов одного генотипа обычно составляют 20–25%. Подтипы 1a и 1b распространены во всем мире и вызывают 60% всех случаев заболевания.

Replication of HCV involves several steps. The virus replicates mainly in the hepatocytes of the liver, where it is estimated that daily each infected cell produces approximately fifty virions (virus particles) with a calculated total of one trillion virions generated. The virus may also replicate in peripheral blood mononuclear cells, potentially accounting for the high levels of immunological disorders found in chronically infected HCV patients. In the liver, the HCV particles are brought into the hepatic sinusoids by blood flow. These sinusoids neighbor hepatocyte cells. Entry into host cells occur through complex interactions between virions, especially through their glycoproteins, and cell surface molecules CD81, LDL receptor, SR BI, DC SIGN, Claudin 1, and Occludin. The envelope of HCV is similar to very low density lipoproteins (VLDL) and low density lipoproteins (LDL). The HCV genome is translated to produce a single protein of around 3,011 amino acids. The polyprotein is then proteolytically processed by viral and cellular proteases to produce three structural (virion associated) and seven nonstructural (NS) proteins. Alternatively, a frameshift may occur in the Core region to produce an alternate reading frame protein (ARFP). HCV encodes two proteases, the NS2 cysteine autoprotease and the NS3 4A serine protease. The NS proteins then recruit the viral genome into an RNA replication complex, which is associated with rearranged cytoplasmic membranes. RNA replication takes place via the viral RNA dependent RNA polymerase NS5B, which produces a negative strand RNA intermediate. The negative strand RNA then serves as a template for the production of new positive strand viral genomes. Nascent genomes can then be translated, further replicated or packaged within new virus particles. The virus replicates on intracellular lipid membranes. The endoplasmic reticulum in particular is deformed into uniquely shaped membrane structures termed 'membranous webs'. These structures can be induced by sole expression of the viral protein NS4B. The core protein associates with lipid droplets and utilises microtubules and dyneins to alter their location to a perinuclear distribution. Release from the hepatocyte may involve the VLDL secretory pathway. Another hypothesis states that the viral particle may be secreted from the endoplasmic reticulum through the endosomal sorting complex required for transport (ESCRT) pathway. Subtypes are further broken down into quasispecies based on their genetic diversity. Genotypes differ by 30–35% of the nucleotide sites over the complete genome. The difference in genomic composition of subtypes of a genotype is usually 20–25%. Subtypes 1a and 1b are found worldwide and cause 60% of all cases.

Клиническое значение

Генотип имеет клиническое значение для определения потенциальной реакции на терапию, основанную на интерфероне, и необходимой продолжительности такой терапии. Генотипы 1 и 4 менее восприимчивы к лечению на основе интерферона, чем другие генотипы (2, 3, 5 и 6). Продолжительность стандартной терапии на основе интерферона при генотипах 1 и 4 составляет 48 недель, в то время как лечение генотипов 2 и 3 завершается за 24 недели. Устойчивый вирусологический ответ достигается в 70% случаев генотипа 1, примерно в 90% случаев генотипов 2 и 3, примерно в 65% случаев генотипа 4 и примерно в 80% случаев генотипа 6. Кроме того, люди африканского происхождения значительно реже реагируют на лечение при инфицировании генотипами 1 или 4. Считается, что значительная доля этого недостаточного ответа на лечение обусловлена однонуклеотидным полиморфизмом (СНП) на 19-й хромосоме генома человека, который является предиктором успеха лечения. Генотипы 1 и 4 ВГС эндемически распространены в перекрывающихся регионах Западной и Центральной Африки, заражая на протяжении веков человеческие популяции, несущие рассматриваемый генетический полиморфизм. Это побудило ученых предположить, что длительное сохранение генотипов 1 и 4 ВГС у людей африканского происхождения является эволюционной адаптацией ВГС на протяжении многих веков к иммуногенетическим реакциям этих популяций. Инфицирование одним генотипом не обеспечивает иммунитет против других, и возможно совместное инфицирование двумя штаммами. В большинстве этих случаев один из штаммов быстро вытесняет другой. Эта находка может быть полезна в лечении, позволяя заменять штаммы, не реагирующие на лекарства, другими, более легко поддающимися лечению.

Рекомбинация

Когда два вируса инфицируют одну и ту же клетку, может произойти генетическая рекомбинация. Хотя рекомбинация вируса гепатита C (ВГС) встречается нечасто, она наблюдалась между разными генотипами, между подтипами одного генотипа и даже между штаммами одного подтипа. В связи с таким способом распространения, основными группами риска являются потребители инъекционных наркотиков, реципиенты продуктов крови и, в некоторых случаях, пациенты, находящиеся на гемодиализе. Распространенным путем передачи ВГС также является внутрибольничное (нозокомиальное) заражение, возникающее при несоблюдении правил гигиены и стерилизации в медицинских учреждениях. Ряд культурных и ритуальных практик были предложены в качестве потенциальных исторических путей распространения ВГС, включая обрезание, генитальные увечья, ритуальную шрамирование, традиционное татуирование и иглоукалывание.

Эволюция

Определение происхождения этого вируса было затруднено, но генотипы 1 и 4, по-видимому, имеют общее происхождение. Байесовский анализ предполагает, что основные генотипы дивергировали примерно 300–400 лет назад от вируса-предка. Менее распространенные генотипы отделились от основных примерно 200 лет назад. Все существующие генотипы, по-видимому, эволюционировали из генотипа 1 подтипа 1b. Исследование штаммов генотипа 6 указывает на более раннюю дату эволюции: примерно 1100–1350 лет до настоящего времени. Оценочная скорость мутации составила 1,8 × 10−4. Экспериментальное исследование оценило скорость мутации в 2,5–2,9 × 10−3 замен оснований на сайт в год. Этот генотип может быть предком других генотипов. Оценочные даты происхождения типов 2a и 3a были 1917 и 1943 годы соответственно. Время дивергенции типов 1a и 1b оценивалось в 200–300 лет. Исследование генотипов 1a и 1b показало, что даты происхождения составляют 1914–1930 годы для типа 1a и 1911–1944 годы для типа 1b. Оба типа 1a и 1b пережили значительное расширение эффективной численности популяции в период с 1940 по 1960 год. Распространение подтипа 1b HCV предшествовало распространению подтипа 1a как минимум на 16 лет. Оба типа, по-видимому, распространились из развитых стран в развивающиеся. Штаммы генотипа 2 из Африки можно разделить на четыре клады, которые коррелируют со страной их происхождения: (1) Камерун и Центральноафриканская Республика, (2) Бенин, Гана и Буркина-Фасо, (3) Гамбия, Гвинея, Гвинея-Бисау и Сенегал, (4) Мадагаскар. Существуют также веские доказательства распространения генотипа 2 HCV из Западной Африки в Карибский бассейн посредством трансатлантической работорговли. Считается, что генотип 3 имеет свое происхождение в Юго-Восточной Азии. Эти данные из разных стран позволяют предположить, что этот вирус мог эволюционировать в Юго-Восточной Азии и был распространен в Западной Африке торговцами из Западной Европы. Позже он был занесен в Японию после отмены политики самоизоляции этой страны. После попадания в страну на его распространение влияли многие местные факторы, включая переливание крови, программы вакцинации, внутривенное употребление наркотиков и схемы лечения. Учитывая снижение скорости распространения после внедрения скрининга на HCV в продуктах крови в 1990-х годах, можно предположить, что ранее переливание крови было важным путем распространения. Необходимы дополнительные исследования для определения дат эволюции различных генотипов и времени их распространения по всему миру.

Identification of the origin of this virus has been difficult but genotypes 1 and 4 appear to share a common origin. A Bayesian analysis suggests that the major genotypes diverged about 300–400 years ago from the common ancestor virus. The minor genotypes diverged about 200 years ago from their major genotypes. All of the extant genotypes appear to have evolved from genotype 1 subtype 1b. A study of genotype 6 strains suggests an earlier date of evolution: approximately 1,100 to 1,350 years Before Present. The estimated rate of mutation was 1.8 × 10−4. An experimental study estimated the mutation rate at 2.5–2.9 × 10−3 base substitutions per site per year. This genotype may be the ancestor of the other genotypes. The estimated dates of origin of types 2a and 3a were 1917 and 1943 respectively. The time of divergence of types 1a and 1b was estimated to be 200–300 years. A study of genotype 1a and 1b estimated the dates of origin to be 1914–1930 for type 1a and 1911–1944 for type 1b. Both types 1a and 1b underwent massive expansions in their effective population size between 1940 and 1960. The expansion of HCV subtype 1b preceded that of subtype 1a by at least 16 years. Both types appear to have spread from the developed world to the developing world. The genotype 2 strains from Africa can be divided into four clades that correlate with their country of origin: (1) Cameroon and Central African Republic (2) Benin, Ghana and Burkina Faso (3) Gambia, Guinea, Guinea Bissau and Senegal (4) Madagascar. There is also strong evidence for the dissemination of HCV genotype 2 from West Africa to the Caribbean by the trans Atlantic slave trade. Genotype 3 is thought to have its origin in South East Asia. These dates from these various countries suggests that this virus may have evolved in South East Asia and was spread to West Africa by traders from Western Europe. It was later introduced into Japan once that country's self imposed isolation was lifted. Once introduced to a country its spread has been influenced by many local factors including blood transfusions, vaccination programmes, intravenous drug use and treatment regimes. Given the reduction in the rate of spread once screening for HCV in blood products was implemented in the 1990s, it would seem that previously blood transfusion was an important method of spread. Additional work is required to determine the dates of evolution of the various genotypes and the timing of their spread across the globe.

Вакцинация

В отличие от гепатитов А и В, в настоящее время не существует вакцины для предотвращения заражения гепатитом С.

Текущие исследования

Исследование ВГС затруднялось узким кругом восприимчивых хозяев. Использование репликонов оказалось успешным, однако они были открыты относительно недавно. ВГС, как и большинство РНК-вирусов, существует в виде вирусного квазивида, что значительно усложняет выделение отдельного штамма или типа рецептора для изучения. Современные исследования сосредоточены на ингибиторах малых молекул вирусной протеазы, РНК-полимеразы и других неструктурных генов. Два препарата – боцепревир от Merck и телапревир от Vertex Pharmaceuticals – оба ингибитора протеазы NS3, были одобрены для применения 13 мая 2011 года и 23 мая 2011 года соответственно. Сообщалось о возможной связи между низким уровнем витамина D и неэффективностью лечения. Эксперименты in vitro показали, что витамин D способен снижать вирусную репликацию. Несмотря на перспективность этих данных, результаты клинических испытаний пока ожидаются. Однако было предложено, что добавление витамина D к стандартной терапии может повысить эффективность лечения. Нарингенин, флавоноид, содержащийся в грейпфруте и других фруктах и травах, продемонстрировал способность блокировать сборку инфекционных вирусных частиц внутри клеток, не влияя на внутриклеточные уровни вирусной РНК или белка. Софосбувир для лечения хронической инфекции гепатита С был одобрен FDA 6 декабря 2013 года. Сообщается, что это первый препарат, продемонстрировавший безопасность и эффективность при лечении определенных типов инфекции ВГС без необходимости сопутствующего применения интерферона. 22 ноября FDA одобрило симепревир для использования в комбинации с пегинтерфероном альфа и рибавирином. Симепревир был одобрен в Японии для лечения хронической инфекции гепатита С, генотип 1. В настоящее время также проводятся экспериментальные исследования немедикаментозных методов терапии. Например, оксиматрин – это экстракт корня, обнаруженный в Азии, который, по сообщениям, обладает противовирусной активностью против ВГС в клеточных культурах и на животных. Небольшие, но многообещающие клинические испытания показали положительные результаты и отсутствие серьезных побочных эффектов, однако их размер был недостаточен для обобщения выводов.

The study of HCV has been hampered by the narrow host range of HCV. The use of replicons has been successful but these have only been recently discovered. HCV, as with most RNA viruses, exists as a viral quasispecies, making it very difficult to isolate a single strain or receptor type for study. Current research is focused on small molecule inhibitors of the viral protease, RNA polymerase and other nonstructural genes. Two agents—boceprevir by Merck and telaprevir by Vertex Pharmaceuticals—both inhibitors of NS3 protease were approved for use on May 13, 2011, and May 23, 2011, respectively. A possible association between low Vitamin D levels and a poor response to treatment has been reported. In vitro work has shown that vitamin D may be able to reduce viral replication. While this work looks promising the results of clinical trials are pending. However, it has been proposed that vitamin D supplementation is important in addition to standard treatment, in order to enhance treatment response. Naringenin, a flavonoid found in grapefruit and other fruits and herbs, has been shown to block the assembly of intracellular infectious viral particles without affecting intracellular levels of the viral RNA or protein. Sofosbuvir for use against chronic hepatitis C infection was approved by the FDA on December 6, 2013. It has been reported to be the first drug that has demonstrated safety and efficacy to treat certain types of HCV infection without the need for co administration of interferon. On November 22, the FDA approved simeprevir for use in combination with peginterferon alfa and ribavirin. Simeprevir has been approved in Japan for the treatment of chronic hepatitis C infection, genotype 1. There is also current experimental research on non drug related therapies. Oxymatrine, for example, is a root extract found in the continent of Asia that has been reported to have antiviral activity against HCV in cell cultures and animal studies. Small and promising human trials have shown beneficial results and no serious side effects, but they were too small to generalize conclusions.