Введение

Лабораторный тест

Электрофорез сывороточных белков (SPEP или SPE) – это лабораторный тест, который исследует специфические белки в крови, называемые глобулинами. Наиболее частыми показаниями для проведения электрофореза сывороточных белков являются диагностика или мониторинг множественной миеломы, моноклональной гаммопатии неясного генеза (МГУС), а также дальнейшее обследование при несоответствии между низким уровнем альбумина и относительно высоким общим содержанием белка. Необъяснимые боли в костях, анемия, протеинурия, хроническая болезнь почек и гиперкальциемия также являются признаками множественной миеломы и показаниями для проведения SPE. Сначала необходимо собрать кровь, обычно в герметичную пробирку или шприц. Электрофорез – это лабораторная техника, при которой сыворотка крови (жидкая часть крови после свертывания) наносится либо на ацетатную мембрану, пропитанную жидким буфером, либо на буферизованный агарозный гель, либо в жидкость в капиллярной трубке, и подвергается воздействию электрического тока для разделения компонентов сывороточных белков на пять основных фракций по размеру и электрическому заряду: сывороточный альбумин, альфа-1 глобулины, альфа-2 глобулины, бета-1 и 2 глобулины и гамма-глобулины.

Ацетатный или гелевый электрофорез

Белки разделяются под действием как электрических, так и электроэндоосмотических сил. Результирующий заряд белка определяется суммарным зарядом его аминокислот и pH буфера. Белки наносятся на твердую матрицу, такую как агарозный гель или мембрана ацетата целлюлозы, в жидком буфере, и прикладывается электрический ток. Белки с отрицательным зарядом мигрируют к положительно заряженному аноду. Альбумин имеет наиболее выраженный отрицательный заряд и мигрирует к аноду дальше всех. Электроэндоосмотический поток – это движение жидкости к катоду, которое вызывает перемещение белков со слабым зарядом в обратном направлении от точки нанесения. Гамма-глобулины в основном разделяются под действием электроэндоосмотических сил. Схему электрофоретических полос, предоставляемую лабораторией, может быть сложно запомнить, поэтому студентам-медикам, интернам, медсестрам и врачам без специальной подготовки могут быть полезны визуальные мнемонические приемы для запоминания пяти основных полос и формы нормального электрофореза сыворотки.

Капилярный электрофорез

При капиллярном электрофорезе отсутствует твердая матрица. Белки разделяются главным образом за счет сильных электроэндосмотических сил. Образец вводится в капилляр с отрицательным поверхностным зарядом. Прикладывается высокий ток, и отрицательно заряженные белки, такие как альбумин, стремятся двигаться к аноду. Жидкий буфер течет к катоду, увлека́я за собой белки с более слабым зарядом.

Альбумин

Альбумин является основной фракцией в нормальном SPEP. Для того чтобы уменьшение стало заметным при электрофорезе, необходимо снижение на 30%. Обычно наблюдается одна полоса. Гетерозиготные особи могут производить бисальбуминемию – две полосы, окрашивающиеся с одинаковой интенсивностью, являющиеся продуктом двух генов. Некоторые варианты приводят к появлению широкой полосы или двух полос разной интенсивности, однако ни один из этих вариантов не связан с заболеванием. Повышенная анодная подвижность возникает в результате связывания с билирубином, неэстерифицированными жирными кислотами, пенициллином и ацетилсалициловой кислотой, а также иногда вследствие триптического расщепления при остром панкреатите. Отсутствие альбумина, известное как анальбуминемия, встречается редко. Снижение уровня альбумина, однако, часто наблюдается при многих заболеваниях, включая заболевания печени, недостаточное питание, нарушение всасывания, протеинурию и энтеропатию.

Альбумин альфа-1 интерзона

Даже окрашивание в этой зоне обусловлено альфа-1 липопротеином (липопротеины высокой плотности – ЛПВП). Снижение наблюдается при тяжелом воспалении, остром гепатите и циррозе печени. Нефротический синдром также может приводить к снижению уровня альбумина из-за его потери с мочой через поврежденный, проницаемый клубочек. Повышение уровня отмечается у лиц, страдающих тяжелым алкоголизмом, а также у женщин во время беременности и в период полового созревания. Высокие уровни альфа-фетопротеина (АФП), которые могут наблюдаться при гепатоцеллюлярной карциноме, могут приводить к появлению четкой полосы между альбумином и альфа-1 зоной.

Альфа-1 зона

Оросумукоид и антитрипсин мигрируют вместе, но оросумукоид плохо окрашивается, поэтому альфа-1 антитрипсин (ААТ) составляет основную часть альфа-1 полосы. Альфа-1 антитрипсин содержит SG-группу, и тиольные соединения могут связываться с белком, изменяя его подвижность. При дефиците наблюдается снижение интенсивности полосы. Интенсивность полосы снижается при нефротическом синдроме, а её отсутствие может указывать на возможный дефицит альфа-1 антитрипсина. Это в конечном итоге приводит к развитию эмфиземы из-за нерегулируемой активности нейтрофильных эластаз в ткани легких. Однако, альфа-1 фракция не исчезает при дефиците альфа-1 антитрипсина, поскольку в этой области мигрируют и другие белки, включая альфа-липопротеины и оросумукоид. ААТ является белком острой фазы, поэтому его уровень повышается при остром воспалении. Белок Бенса-Джонса может связываться с альфа-1 полосой и замедлять её миграцию.

Альфа-1 альфа-2 межзона

Можно увидеть две слабые полосы, соответствующие альфа-1 антихимотрипсину и белку, связывающему витамин D. Эти полосы сливаются и становятся более интенсивными на ранних стадиях воспаления из-за повышения уровня альфа-1 антихимотрипсина, белка острой фазы.

Альфа-2 зона

Эта зона состоит главным образом из альфа-2 макроглобулина (AMG или A2M) и гаптоглобина. При гемолитической анемии обычно наблюдаются низкие уровни (гаптоглобин – это молекула, связывающая свободный гемоглобин, высвобождаемый из эритроцитов, и эти комплексы быстро удаляются фагоцитами). Уровень гаптоглобина повышается в рамках острой фазовой реакции, что приводит к типичному увеличению альфа-2 зоны при воспалении. Нормальная альфа-2 зона и повышенная альфа-1 зона характерны для метастазов в печень и цирроза. Комплексы гаптоглобина/гемоглобина мигрируют более катодно, чем гаптоглобин, что проявляется в интерзоне альфа-2 – бета. Это обычно выглядит как расширение альфа-2 зоны. У детей и пожилых людей может быть повышен уровень альфа-2 макроглобулина, что проявляется четким передним краем альфа-2 полосы. AMG значительно повышается (в 10 раз и более) при потере гломерулярного белка, как при нефротическом синдроме. Благодаря своим большим размерам, AMG не может проникать через гломерулы, в то время как другие белки с меньшей молекулярной массой теряются. Усиленный синтез AMG объясняет его абсолютное увеличение при нефротическом синдроме. Повышение AMG также отмечается у крыс с низким содержанием альбумина, что указывает на то, что это реакция на низкий уровень альбумина, а не на сам нефротический синдром.

AMG умеренно повышается на ранних стадиях диабетической нефропатии.

Альфа-2 - бета межзона

Нерастворимый в холоде глобулин образует полосу в этой области, которая не видна в плазме из-за осаждения гепарином. Его уровень снижен при воспалении и повышен при беременности. Бета-липопротеин формирует неровную, изъязвленную полосу в этой зоне. Повышенные уровни наблюдаются при гиперхолестеринемии II типа, гипертриглицеридемии и нефротическом синдроме.

Бета-зона

Трансферрин и бета-липопротеины (ЛПНП) составляют бета-1 фракцию. Повышение уровня бета-1 белка, обусловленное увеличением концентрации свободного трансферрина, характерно для железодефицитной анемии, беременности и терапии эстрогенами. Увеличение бета-1 белка вследствие повышения уровня ЛПНП наблюдается при гиперхолестеринемии. Снижение уровня бета-1 белка происходит при острых или хронических воспалительных процессах. Бета-2 фракция состоит из C3 (компонента комплемента 3). Его уровень повышается в острой фазе воспалительного ответа. Снижение уровня C3 наблюдается при аутоиммунных заболеваниях, поскольку система комплемента активируется, а C3 связывается с иммунными комплексами и удаляется из сыворотки. Фибриноген, белок бета-2 фракции, содержится в нормальной плазме, но отсутствует в нормальной сыворотке. Иногда кровь, взятая у пациентов, получавших гепарин, свертывается не полностью, что приводит к появлению видимой полосы фибриногена между бета- и гамма-глобулинами.

Бета-гамма межзона

C-реактивный белок обнаруживается между бета- и гамма-зонами, вызывая бета-гамма-слияние. IgA имеет наибольшую анодальную подвижность и обычно мигрирует в области между бета- и гамма-зонами, также вызывая бета-гамма-слияние у пациентов с циррозом печени, респираторной инфекцией, кожными заболеваниями или ревматоидным артритом (при повышенном уровне IgA). Фибриноген в образцах плазмы будет виден в бета-гамма-области. Фибриноген, бета-2 белок, содержится в нормальной плазме, но отсутствует в нормальной сыворотке. Иногда кровь, взятая у пациентов, получавших гепарин, не свертывается полностью, что приводит к появлению видимой полосы фибриногена между бета- и гамма-глобулинами.

Гамма-зона

Иммуноглобулины или антитела, как правило, являются единственными белками, присутствующими в нормальной гамма-области. Важно отметить, что любой белок, мигрирующий в гамма-регионе, будет окрашен и отобразится на геле, что может включать белковые контаминанты, артефакты или определенные лекарственные препараты. В зависимости от того, используется ли метод с агарозой или капиллярный метод, интерференции могут различаться. Иммуноглобулины состоят из тяжелых цепей (μ, δ, γ, α и ε) и легких цепей (κ и λ). Нормальная гамма-зона должна выглядеть как гладкое "опалесцирование" или размытие, без асимметрии или острых пиков. Уровень гамма-глобулинов может быть повышен (гипергаммаглобулинемия), снижен (гипогаммаглобулинемия) или иметь аномальный пик или пики. Следует отметить, что иммуноглобулины могут также обнаруживаться в других зонах; IgA обычно мигрирует в бета-гамма-зоне, и, в частности, патогенные иммуноглобулины могут мигрировать куда угодно, включая альфа-области. Гипогаммаглобулинемия легко идентифицируется как "провал" или снижение в гамма-зоне. Это нормально у младенцев. Она встречается у пациентов с X-сцепленной агаммаглобулинемией. Дефицит IgA встречается у 1 из 500 человек в популяции, что может проявляться бледностью в гамма-зоне. Важно отметить, что гипогаммаглобулинемия может наблюдаться в контексте МГЮС или множественной миеломы. Если в гамма-зоне наблюдается увеличение, первым шагом в интерпретации является определение, является ли область узкой или широкой. Широкое "вздутие" (широкая) указывает на поликлональную продукцию иммуноглобулинов. Если она повышена асимметрично или с одним или несколькими пиками или узкими "шипами", это может указывать на клональную продукцию одного или нескольких иммуноглобулинов.

Поликлональная гаммапатия характеризуется "вздутием" в гамма-зоне, что обычно указывает на не-неопластическое состояние (хотя это не исключает неопластические состояния). Наиболее распространенными причинами поликлональной гипергаммаглобулинемии, выявленной при электрофорезе, являются тяжелые инфекции, хронические заболевания печени, ревматоидный артрит, системная красная волчанка и другие заболевания соединительной ткани. Узкий пик указывает на моноклональную гаммапатию, также известную как ограниченная полоса или "M-пик". Для подтверждения того, что ограниченная полоса является иммуноглобулином, проводится последующее тестирование с использованием иммунофиксации или иммунодислокации/иммуносубтракции (капиллярные методы). Терапевтические моноклональные антитела (mAb) также мигрируют в этой области и могут быть ошибочно интерпретированы как моноклональная гаммапатия, и их также можно идентифицировать с помощью иммунофиксации или иммунодислокации/иммуносубтракции, поскольку они структурно сопоставимы с человеческими иммуноглобулинами. Наиболее распространенной причиной ограниченной полосы является МГЮС (моноклональная гаммапатия неопределенной значимости), которая, хотя и является необходимым предшественником, редко прогрессирует в множественную миелому (в среднем 1% в год). Обычно моноклональная гаммапатия имеет злокачественное или клональное происхождение, при этом миелома является наиболее распространенной причиной пиков IgA и IgG. Хроническая лимфатическая лейкемия и лимфосаркома также не редко встречаются и обычно приводят к выработке парапротеинов IgM. Важно отметить, что до 8% здоровых пожилых пациентов могут иметь моноклональный пик. Макроглобулинемия Вальденстрема (IgM), моноклональная гаммапатия неопределенной значимости (МГЮС), амилоидоз, плазмоклеточная лейкемия и солитарные плазмоцитомы также продуцируют M-пик. Олигоклональная гаммапатия проявляется наличием одного или нескольких дискретных клонов. Лизозим может быть виден в виде полосы, катиональной к гамма-зоне, при миеломоноцитарной лейкемии, где он высвобождается из опухолевых клеток.