Гелевый электрофорез: методы разделения и анализа биомолекул.

Введение

Метод разделения и анализа биомолекул

Гелевый электрофорез – это метод разделения и анализа биомакромолекул (ДНК, РНК, белков и т. д.) и их фрагментов, основанный на их размере и заряде. Он используется в клинической химии для разделения белков по заряду или размеру (IEF-агарозный гель, по сути, не зависящий от размера) и в биохимии и молекулярной биологии для разделения смешанной популяции фрагментов ДНК и РНК по длине, для оценки размера фрагментов ДНК и РНК или для разделения белков по заряду. Молекулы нуклеиновых кислот разделяются путем приложения электрического поля для перемещения отрицательно заряженных молекул через матрицу из агарозы или других веществ. Более короткие молекулы двигаются быстрее и мигрируют дальше, чем более длинные, поскольку более короткие молекулы легче проходят через поры геля. Это явление называется просеиванием. Белки разделяются по заряду в агарозном геле, поскольку поры геля слишком велики для просеивания белков. Гелевый электрофорез также может использоваться для разделения наночастиц. При гелевом электрофорезе гель используется в качестве среды, предотвращающей конвекцию, или просеивающей среды во время электрофореза – движения заряженной частицы в электрическом токе. Гели подавляют тепловую конвекцию, вызванную приложением электрического поля, и также могут действовать как просеивающая среда, замедляя прохождение молекул; гели также могут просто служить для сохранения полученного разделения, чтобы после электрофореза можно было провести окрашивание. Электрофорез ДНК в геле обычно выполняется в аналитических целях, часто после амплификации ДНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), но может использоваться в качестве подготовительной техники перед применением других методов, таких как масс-спектрометрия, РФЛП, ПЦР, клонирование, секвенирование ДНК или южный блоттинг для дальнейшей характеристики.

Физическая основа

Электрофорез – это процесс, позволяющий разделять молекулы на основе заряда, размера или формы. Используя электрическое поле, молекулы (например, ДНК) могут перемещаться через гель, изготовленный из агарозы или полиакриламида. Электрическое поле состоит из отрицательного заряда на одном конце, который проталкивает молекулы через гель, и положительного заряда на другом конце, который притягивает молекулы через гель. Разделяемые молекулы помещаются в лунки в гелевом материале. Гель помещается в камеру для электрофореза, которая затем подключается к источнику питания. При приложении электрического поля более крупные молекулы движутся через гель медленнее, а меньшие – быстрее. Молекулы разных размеров образуют отчетливые полосы на геле. В данном контексте термин «гель» относится к матрице, используемой для удержания и последующего разделения целевых молекул. В большинстве случаев гель представляет собой сшитый полимер, состав и пористость которого подбираются в зависимости от молекулярной массы и состава анализируемого вещества. При разделении белков или небольших нуклеиновых кислот (ДНК, РНК или олигонуклеотидов) гель обычно состоит из различных концентраций акриламида и сшивающего агента, формируя полиакриламидную сетку различного размера пор. Для разделения крупных нуклеиновых кислот (более нескольких сотен оснований) предпочтительной матрицей является очищенная агароза. В обоих случаях гель образует твердую, но пористую матрицу. Акриламид, в отличие от полиакриламида, является нейротоксином и требует осторожного обращения с соблюдением соответствующих мер безопасности для предотвращения отравления. Агароза состоит из длинных неразветвленных цепей незаряженных углеводов без сшивок, что приводит к образованию геля с большими порами, позволяющими разделять макромолекулы и макромолекулярные комплексы. Электрофорез подразумевает использование электродвижущей силы (ЭДС) для перемещения молекул через гелевую матрицу. Помещая молекулы в лунки геля и прикладывая электрическое поле, молекулы будут двигаться по матрице с разной скоростью, в основном определяемой их массой при условии одинакового отношения заряда к массе (Z) для всех видов. Однако, если заряды неоднородны, электрическое поле, создаваемое процедурой электрофореза, приведет к дифференциальной миграции молекул в зависимости от заряда. Виды с положительным чистым зарядом будут мигрировать к катоду, который имеет отрицательный заряд (поскольку это электролитическая, а не гальваническая ячейка), а виды с отрицательным чистым зарядом – к положительно заряженному аноду. Масса остается фактором, влияющим на скорость миграции этих неравномерно заряженных молекул через матрицу к соответствующим электродам. Если несколько образцов загружены в соседние лунки геля, они будут пробегать параллельно в отдельных дорожках. В зависимости от количества различных молекул каждая дорожка отображает разделение компонентов исходной смеси в виде одной или нескольких отдельных полос, по одной полосе на компонент. Неполное разделение компонентов может привести к перекрытию полос или неразличимым размазням, представляющим несколько неразрешенных компонентов. Полосы в разных дорожках, которые оказываются на одинаковом расстоянии от начала, содержат молекулы, прошедшие через гель с одинаковой скоростью, что обычно указывает на их приблизительно одинаковый размер. Существуют маркеры молекулярной массы, содержащие смесь молекул известных размеров. Если такой маркер запускается в одной дорожке геля параллельно с неизвестными образцами, наблюдаемые полосы можно сравнить с полосами неизвестных образцов для определения их размера. Расстояние, которое проходит полоса, приблизительно обратно пропорционально логарифму размера молекулы (или, что то же самое, пройденное расстояние обратно пропорционально логарифму молекулярной массы образца). Существуют ограничения электрофоретических методов. Поскольку прохождение тока через гель вызывает нагрев, гели могут плавиться во время электрофореза. Электрофорез проводится в буферных растворах для уменьшения изменений pH, вызванных электрическим полем, что важно, поскольку заряд ДНК и РНК зависит от pH, но слишком длительное время работы может истощить буферную емкость раствора. Также существуют ограничения в определении молекулярной массы методом SDS-PAGE, особенно при попытке определить молекулярную массу неизвестного белка. Определенные биологические факторы трудно или невозможно минимизировать, и они могут влиять на электрофоретическую миграцию. К таким факторам относятся структура белка, посттрансляционные модификации и аминокислотный состав. Например, тропомиозин – это кислый белок, который аномально мигрирует в SDS-PAGE гелях. Это связано с тем, что кислые остатки отталкиваются от отрицательно заряженного SDS, что приводит к неточному отношению заряда к массе и миграции. Кроме того, различные препараты генетического материала могут мигрировать непоследовательно друг с другом по морфологическим или другим причинам.

Electrophoresis is a process that enables the sorting of molecules based on charge, size, or shape. Using an electric field, molecules (such as DNA) can be made to move through a gel made of agarose or polyacrylamide. The electric field consists of a negative charge at one end which pushes the molecules through the gel, and a positive charge at the other end that pulls the molecules through the gel. The molecules being sorted are dispensed into a well in the gel material. The gel is placed in an electrophoresis chamber, which is then connected to a power source. When the electric field is applied, the larger molecules move more slowly through the gel while the smaller molecules move faster. The different sized molecules form distinct bands on the gel. The term "gel" in this instance refers to the matrix used to contain, then separate the target molecules. In most cases, the gel is a crosslinked polymer whose composition and porosity are chosen based on the specific weight and composition of the target to be analyzed. When separating proteins or small nucleic acids (DNA, RNA, or oligonucleotides) the gel is usually composed of different concentrations of acrylamide and a cross linker, producing different sized mesh networks of polyacrylamide. When separating larger nucleic acids (greater than a few hundred bases), the preferred matrix is purified agarose. In both cases, the gel forms a solid, yet porous matrix. Acrylamide, in contrast to polyacrylamide, is a neurotoxin and must be handled using appropriate safety precautions to avoid poisoning. Agarose is composed of long unbranched chains of uncharged carbohydrates without cross links resulting in a gel with large pores allowing for the separation of macromolecules and macromolecular complexes. Electrophoresis refers to the electromotive force (EMF) that is used to move the molecules through the gel matrix. By placing the molecules in wells in the gel and applying an electric field, the molecules will move through the matrix at different rates, determined largely by their mass when the charge to mass ratio (Z) of all species is uniform. However, when charges are not all uniform the electrical field generated by the electrophoresis procedure will cause the molecules to migrate differentially according to charge. Species that are net positively charged will migrate towards the cathode which is negatively charged (because this is an electrolytic rather than galvanic cell), whereas species that are net negatively charged will migrate towards the positively charged anode. Mass remains a factor in the speed with which these non uniformly charged molecules migrate through the matrix toward their respective electrodes. If several samples have been loaded into adjacent wells in the gel, they will run parallel in individual lanes. Depending on the number of different molecules, each lane shows the separation of the components from the original mixture as one or more distinct bands, one band per component. Incomplete separation of the components can lead to overlapping bands, or indistinguishable smears representing multiple unresolved components. Bands in different lanes that end up at the same distance from the top contain molecules that passed through the gel at the same speed, which usually means they are approximately the same size. There are molecular weight size markers available that contain a mixture of molecules of known sizes. If such a marker was run on one lane in the gel parallel to the unknown samples, the bands observed can be compared to those of the unknown to determine their size. The distance a band travels is approximately inversely proportional to the logarithm of the size of the molecule (alternatively, this can be stated as the distance traveled is inversely proportional to the log of samples's molecular weight). There are limits to electrophoretic techniques. Since passing a current through a gel causes heating, gels may melt during electrophoresis. Electrophoresis is performed in buffer solutions to reduce pH changes due to the electric field, which is important because the charge of DNA and RNA depends on pH, but running for too long can exhaust the buffering capacity of the solution. There are also limitations in determining the molecular weight by SDS PAGE, especially when trying to find the MW of an unknown protein. Certain biological variables are difficult or impossible to minimize and can affect electrophoretic migration. Such factors include protein structure, post translational modifications, and amino acid composition. For example, tropomyosin is an acidic protein that migrates abnormally on SDS PAGE gels. This is because the acidic residues are repelled by the negatively charged SDS, leading to an inaccurate mass to charge ratio and migration. Further, different preparations of genetic material may not migrate consistently with each other, for morphological or other reasons.

Типы геля

Наиболее часто используемыми типами гелей являются гели агарозы и полиакриламида. Каждый тип геля хорошо подходит для анализа различных типов и размеров анализируемых веществ. Полиакриламидные гели обычно используются для белков и обладают очень высоким разрешением при разделении небольших фрагментов ДНК (5–500 бп). Гели агарозы, напротив, имеют более низкое разрешение для ДНК, но обеспечивают больший диапазон разделения, поэтому они используются для фрагментов ДНК размером обычно от 50 до 20 000 бп, хотя разрешение более 6 Мб возможно при использовании импульсного полевого электрофореза (PFGE). Полиакриламидные гели заливают и проводят электрофорез в вертикальной конфигурации, а агарозные гели обычно заливают и проводят электрофорез горизонтально в подводном режиме. Они также различаются по методу приготовления: агароза застывает при охлаждении, а полиакриламид формируется в результате химической реакции полимеризации.

Агароза

Гели агарозы изготавливаются из натуральных полисахаридных полимеров, извлекаемых из морских водорослей. Гели агарозы легко отливать и обрабатывать по сравнению с другими матрицами, поскольку затвердевание геля – это физическое, а не химическое изменение. Образцы также легко извлекаются. После завершения эксперимента полученный гель можно хранить в пластиковом пакете в холодильнике. Гели агарозы не имеют однородного размера пор, но оптимальны для электрофореза белков размером более 200 кДа. Электрофорез в агарозном геле также может использоваться для разделения фрагментов ДНК длиной от 50 пар оснований до нескольких мегабаз (миллионов оснований), для разделения самых крупных из которых требуется специализированное оборудование. Расстояние между полосами ДНК разной длины зависит от процентного содержания агарозы в геле: более высокие проценты требуют более длительного времени электрофореза, иногда – нескольких дней. Вместо этого гели агарозы с высоким содержанием следует использовать с импульсным электрофорезом (PFE) или электрофорезом с инверсией поля. "Большинство агарозных гелей изготавливаются с использованием 0,7% (для хорошего разделения или разрешения крупных фрагментов ДНК размером 5–10 кб) и 2% (для хорошего разрешения мелких фрагментов 0,2–1 кб) агарозы, растворенной в буфере для электрофореза. До 3% можно использовать для разделения очень маленьких фрагментов, но в этом случае более подходящим является вертикальный полиакриламидный гель. Гели с низким содержанием агарозы очень непрочные и могут сломаться при попытке их перемещения. Гели с высоким содержанием агарозы часто хрупкие и застывают неравномерно. Гели с концентрацией 1% широко используются для многих применений."

Полиакриламид

Электрофорез в полиакриламидном геле (PAGE) используется для разделения белков размером от 5 до 2000 кДа благодаря равномерному размеру пор, обеспечиваемому полиакриламидным гелем. Размер пор контролируется путем изменения концентраций акриламида и бис-акриламида в порошке, используемых при создании геля. При создании гелей такого типа необходимо соблюдать осторожность, поскольку акриламид является сильным нейротоксином как в жидкой, так и в порошкообразной форме. Традиционные методы секвенирования ДНК, такие как методы Максама-Гильберта или Сэнгера, использовали полиакриламидные гели для разделения фрагментов ДНК, различающихся всего на одно основание, чтобы можно было определить последовательность. В настоящее время большинство современных методов разделения ДНК используют гели агарозы, за исключением очень маленьких фрагментов ДНК. В настоящее время PAGE наиболее часто используется в иммунологии и анализе белков, часто для разделения различных белков или изоформ одного и того же белка на отдельные полосы. Эти полосы можно перенести на мембрану из нитроцеллюлозы или ПВДФ для дальнейшего исследования с помощью антител и соответствующих маркеров, например, при вестерн-блоттинге. Обычно гели для разрешения изготавливаются с концентрацией 6%, 8%, 10%, 12% или 15%. На гель для разрешения заливают концентрирующий гель (5%), а затем вставляют гребень для формирования лунок, определяющих дорожки для белков, буфера для образцов и маркеров молекулярного веса. Выбор концентрации зависит от размера белка, который необходимо идентифицировать или исследовать в образце. Чем меньше известный молекулярный вес, тем выше должна быть концентрация геля. Изменение буферной системы геля может помочь в дальнейшем разрешении белков очень малых размеров.

Крахмал

Частично гидролизованный картофельный крахмал представляет собой еще одну нетоксичную среду для электрофореза белков. Гели немного более мутные, чем акриламидные или агарозные. Не денатурированные белки разделяются по заряду и размеру. Визуализация проводится с использованием окрашивания Нафтал Блэк или Амидо Блэк. Типичные концентрации крахмала в геле составляют от 5% до 10%.

Денетурирование

Денатурирующие гели работают в условиях, разрушающих естественную структуру анализируемого вещества, что приводит к его разворачиванию в линейную цепь. Таким образом, подвижность каждой макромолекулы зависит только от ее линейной длины и отношения массы к заряду. Это приводит к нарушению вторичной, третичной и четвертичной структур биомолекул, оставляя для анализа только первичную структуру. Нуклеиновые кислоты часто денатурируют добавлением мочевины в буфер, а белки – с помощью додецилсульфата натрия, обычно в процессе SDS-PAGE. Для полной денатурации белков также необходимо разрушить ковалентные дисульфидные связи, стабилизирующие их третичную и четвертичную структуру, что достигается методом редуцирующего ПАГЭ. Редуцирующие условия обычно поддерживаются добавлением бета-меркаптоэтанола или дитиотрейтола. Для общего анализа белковых образцов редуцирующий ПАГЭ является наиболее распространенной формой белкового электрофореза. Денатурирующие условия необходимы для точной оценки молекулярной массы РНК. РНК способна образовывать больше внутримолекулярных взаимодействий, чем ДНК, что может влиять на ее электрофоретическую подвижность. Мочевина, ДМСО и глиоксаль – наиболее часто используемые денатурирующие агенты для разрушения структуры РНК. Изначально для денатурирующего электрофореза РНК часто использовали высокотоксичный гидроксид метилртути, однако для некоторых образцов он может быть методом выбора. Денатурирующий гелевый электрофорез используется в методах, основанных на полосном рисунке ДНК и РНК, таких как температурно-градиентный гелевый электрофорез (TGGE) и денатурирующий градиентный гелевый электрофорез (DGGE).

Местные

Нативные гели используются в неденатурирующих условиях, чтобы сохранить естественную структуру аналита. Это позволяет физическому размеру сложенного или собранного комплекса влиять на подвижность, что дает возможность анализировать все четыре уровня биомолекулярной структуры. Для биологических образцов детергенты используются только в той степени, в которой они необходимы для лизиса липидных мембран клетки. Комплексы в основном остаются ассоциированными и сложенными, как и в клетке. Однако одним из недостатков является то, что комплексы могут разделяться нечетко или непредсказуемо, поскольку трудно предсказать, как форма и размер молекулы повлияют на ее подвижность. Преодоление и решение этой проблемы – основная цель препаративного нативного ПАГЭ. В отличие от денатурирующих методов, нативный гель-электрофорез не использует заряженный денатурирующий агент. Следовательно, молекулы, которые разделяются (обычно белки или нуклеиновые кислоты), различаются не только молекулярной массой и внутренним зарядом, но и площадью поперечного сечения, и, таким образом, испытывают различные электрофоретические силы, зависящие от формы общей структуры. Для белков, поскольку они остаются в нативном состоянии, их можно визуализировать не только общими белковыми красителями, но и специфическими ферментно-связанными красителями. Конкретным примером экспериментального применения нативного гель-электрофореза является проверка ферментативной активности для подтверждения присутствия фермента в образце во время очистки белка. Например, для белка щелочной фосфатазы, раствор для окрашивания представляет собой смесь 4-хлор-2-метилбензолдиазония с 3-фосфо-2-нафтойной кислотой 2',4'-диметиланилина в Tris-буфере. Этот краситель продается в коммерческой продаже в виде набора для окрашивания гелей. Если белок присутствует, механизм реакции протекает в следующем порядке: он начинается с дефосфорилирования 3-фосфо-2-нафтойной кислоты 2',4'-диметиланилина щелочной фосфатазой (для реакции требуется вода). Фосфатная группа высвобождается и заменяется спиртовой группой из воды. Электрофильный 4-хлор-2-метилбензолдиазоний (соль диазония Fast Red TR) вытесняет спиртовую группу, образуя конечный продукт – красный азокраситель. Как следует из названия, это конечный видимый красный продукт реакции. В учебных экспериментах по очистке белка гель обычно запускают рядом с коммерчески очищенными образцами, чтобы визуализировать результаты и сделать вывод об успешности очистки. Нативный гель-электрофорез обычно используется в протеомике и металломике. Однако нативный ПАГЭ также используется для сканирования генов (ДНК) на предмет неизвестных мутаций, как, например, в полиморфизме одноцепочечной конформации.

Native gels are run in non denaturing conditions so that the analyte's natural structure is maintained. This allows the physical size of the folded or assembled complex to affect the mobility, allowing for analysis of all four levels of the biomolecular structure. For biological samples, detergents are used only to the extent that they are necessary to lyse lipid membranes in the cell. Complexes remain—for the most part—associated and folded as they would be in the cell. One downside, however, is that complexes may not separate cleanly or predictably, as it is difficult to predict how the molecule's shape and size will affect its mobility. Addressing and solving this problem is a major aim of preparative native PAGE. Unlike denaturing methods, native gel electrophoresis does not use a charged denaturing agent. The molecules being separated (usually proteins or nucleic acids) therefore differ not only in molecular mass and intrinsic charge, but also the cross sectional area, and thus experience different electrophoretic forces dependent on the shape of the overall structure. For proteins, since they remain in the native state they may be visualized not only by general protein staining reagents but also by specific enzyme linked staining. A specific experiment example of an application of native gel electrophoresis is to check for enzymatic activity to verify the presence of the enzyme in the sample during protein purification. For example, for the protein alkaline phosphatase, the staining solution is a mixture of 4 chloro 2 2methylbenzenediazonium salt with 3 phospho 2 naphthoic acid 2' 4' dimethyl aniline in Tris buffer. This stain is commercially sold as a kit for staining gels. If the protein is present, the mechanism of the reaction takes place in the following order: it starts with the de phosphorylation of 3 phospho 2 naphthoic acid 2' 4' dimethyl aniline by alkaline phosphatase (water is needed for the reaction). The phosphate group is released and replaced by an alcohol group from water. The electrophile 4 chloro 2 2 methylbenzenediazonium (Fast Red TR Diazonium salt) displaces the alcohol group forming the final product Red Azo dye. As its name implies, this is the final visible red product of the reaction. In undergraduate academic experimentation of protein purification, the gel is usually run next to commercial purified samples to visualize the results and conclude whether or not purification was successful. Native gel electrophoresis is typically used in proteomics and metallomics. However, native PAGE is also used to scan genes (DNA) for unknown mutations as in single strand conformation polymorphism.

Буферы

Буферы в гелевом электрофорезе используются для обеспечения ионов, переносящих электрический ток, и поддержания pH на относительно постоянном уровне. Эти буферы содержат большое количество ионов, что необходимо для прохождения электричества через них. Дистиллированная вода или бензол, например, содержат мало ионов, что не подходит для использования в электрофорезе. Существует множество буферов, применяемых для электрофореза. Наиболее распространенными для нуклеиновых кислот являются Tris/Acetate/EDTA (TAE) и Tris/Borate/EDTA (TBE). Предложено множество других буферов, например, борат лития (LB), редко используемый, судя по данным Pubmed, изоэлектрический гистидин, буферы с подобранным значением pK и т.д. В большинстве случаев предполагаемое обоснование – снижение тока (меньшее выделение тепла) за счет согласования ионной подвижности, что увеличивает срок службы буфера. Борат является проблематичным, поскольку он может полимеризоваться или взаимодействовать с цис-диолами, такими как те, что содержатся в РНК. TAE обладает наименьшей буферной емкостью, но обеспечивает наилучшее разрешение для крупных молекул ДНК. Это означает использование более низкого напряжения и большего времени, но получение лучшего результата. LB – относительно новый буфер, неэффективный при разделении фрагментов размером более 5 кб; однако, благодаря низкой проводимости, можно использовать значительно более высокое напряжение (до 35 В/см), что сокращает время анализа при рутинном электрофорезе. Даже разница в размере всего в одну пару оснований может быть разрешена в 3% агарозном геле со средой с очень низкой проводимостью (1 мМ бората лития). Большинство разделений белков SDS-PAGE проводятся с использованием "разрывной" (или DISC) буферной системы, которая значительно повышает четкость полос в геле. Во время электрофореза в разрывной гелевой системе на ранней стадии формируется ионный градиент, который заставляет все белки фокусироваться в одной четкой полосе в процессе, называемом изотахофорезом. Разделение белков по размеру происходит в нижней, "разрешающей" области геля. Разрешающий гель обычно имеет значительно меньший размер пор, что создает эффект просеивания, определяющий электрофоретическую подвижность белков.

Buffers in gel electrophoresis are used to provide ions that carry a current and to maintain the pH at a relatively constant value. These buffers have plenty of ions in them, which is necessary for the passage of electricity through them. Something like distilled water or benzene contains few ions, which is not ideal for the use in electrophoresis. There are a number of buffers used for electrophoresis. The most common being, for nucleic acids Tris/Acetate/EDTA (TAE), Tris/Borate/EDTA (TBE). Many other buffers have been proposed, e. g. lithium borate, which is rarely used, based on Pubmed citations (LB), isoelectric histidine, pK matched goods buffers, etc. ; in most cases the purported rationale is lower current (less heat) matched ion mobilities, which leads to longer buffer life. Borate is problematic; Borate can polymerize, or interact with cis diols such as those found in RNA. TAE has the lowest buffering capacity but provides the best resolution for larger DNA. This means a lower voltage and more time, but a better product. LB is relatively new and is ineffective in resolving fragments larger than 5 kbp; However, with its low conductivity, a much higher voltage could be used (up to 35 V/cm), which means a shorter analysis time for routine electrophoresis. As low as one base pair size difference could be resolved in 3% agarose gel with an extremely low conductivity medium (1 mM Lithium borate). Most SDS PAGE protein separations are performed using a "discontinuous" (or DISC) buffer system that significantly enhances the sharpness of the bands within the gel. During electrophoresis in a discontinuous gel system, an ion gradient is formed in the early stage of electrophoresis that causes all of the proteins to focus on a single sharp band in a process called isotachophoresis. Separation of the proteins by size is achieved in the lower, "resolving" region of the gel. The resolving gel typically has a much smaller pore size, which leads to a sieving effect that now determines the electrophoretic mobility of the proteins.

Визуализация

После завершения электрофореза молекулы в геле можно окрасить для визуализации. ДНК можно визуализировать с помощью бромида этидия, который, внедряясь в структуру ДНК, флуоресцирует под воздействием ультрафиолетового света, а белки – с помощью протравливания серебром или красителя Кумасси бриллиантовый синий. Для визуализации разделения компонентов смеси в геле могут быть использованы и другие методы. Если разделяемые молекулы содержат радиоактивные изотопы, например, в геле для секвенирования ДНК, можно получить авторадиограмму геля. Фотографии гелей часто делают с использованием системы Gel Doc. Затем гели обычно маркируют для подготовки презентаций и научных отчетов, используя популярный веб-сайт для создания графиков SciUGo.

Дальнейшая переработка

После разделения может быть использован дополнительный метод разделения, например, изоэлектрическое фокусирование или SDS-PAGE. Затем гель физически разрезают, и белковые комплексы извлекают из каждой части по отдельности. Каждый экстракт затем может быть проанализирован, например, с помощью пептидного масс-спектрометрического анализа или de novo секвенирования пептидов после внутригелевого расщепления. Это позволяет получить значительный объем информации об идентичности белков в комплексе.

Приложения

Оценка размеров молекул ДНК после обработки ферментами рестрикции, например, при построении рестрикционных карт клонированной ДНК. Анализ продуктов ПЦР, например, в молекулярно-генетической диагностике или генетическом типировании. Разделение рестриктированной геномной ДНК перед переносом на мембрану для саузерн-блотинга или РНК перед переносом на мембрану для нозерн-блотинга. Гель-электрофорез используется в криминалистике, молекулярной биологии, генетике, микробиологии и биохимии. Результаты можно анализировать количественно, визуализируя гель в ультрафиолетовом свете с помощью системы визуализации гелей. Изображение регистрируется с помощью компьютерной камеры, а интенсивность полосы или пятна измеряется и сравнивается со стандартами или маркерами, загруженными на тот же гель. Измерения и анализ в основном выполняются с помощью специализированного программного обеспечения. В зависимости от типа проводимого анализа, другие методы часто используются в сочетании с результатами гель-электрофореза, что обеспечивает широкий спектр применений в различных областях.

Нуклеиновые кислоты

В случае нуклеиновых кислот направление миграции от отрицательного к положительному электроду обусловлено естественным отрицательным зарядом, переносимым их сахарофосфатным остовом. Двухцепочечные фрагменты ДНК естественным образом ведут себя как длинные стержни, поэтому их миграция через гель зависит от их размера или, для циклических фрагментов, от радиуса их вращения. Однако, круговая ДНК, такая как плазмиды, может давать несколько полос, при этом скорость миграции может зависеть от того, находится она в расслабленном или суперспирализованном состоянии. Одноцепочечная ДНК или РНК склонна сворачиваться в молекулы сложной формы и мигрировать через гель сложным образом, определяемым их третичной структурой. Поэтому для денатурации нуклеиновых кислот и придания им формы длинных стержней используются агенты, разрушающие водородные связи, такие как гидроксид натрия или формамид. Электрофорез больших молекул ДНК или РНК обычно проводят с использованием агарозного геля. Пример геля для секвенирования ДНК полиакриламидом можно найти на странице "метод обрыва цепи". Характеризация нуклеиновых кислот или их фрагментов посредством взаимодействия с лигандами может быть выполнена с помощью электрофореза со сдвигом подвижности в аффинном поле. Электрофорез образцов РНК может быть использован для выявления контаминации геномной ДНК, а также для оценки степени деградации РНК. РНК эукариотических организмов демонстрирует отчетливые полосы 28S и 18S рРНК, причем интенсивность полосы 28S примерно в два раза выше, чем у 18S. Деградированная РНК имеет менее четкие полосы, выглядит размытой, а соотношение интенсивностей составляет менее 2:1.

Белки

Белки, в отличие от нуклеиновых кислот, могут иметь различные заряды и сложную структуру, поэтому они могут мигрировать в полиакриламидном геле с разной скоростью, или не мигрировать вовсе при воздействии электрического поля. Поэтому белки обычно денатурируют в присутствии детергента, такого как додецилсульфат натрия (SDS), который покрывает белки отрицательным зарядом. Это делается для получения более однородного образца (например, с более узким распределением по размерам частиц), который затем можно использовать в дальнейших продуктах или процессах (например, в процессах самосборки). Для разделения наночастиц в геле ключевым параметром является отношение размера частиц к размеру пор геля, при этом выделяют два механизма миграции: неограниченный, когда размер частиц значительно меньше размера пор, и ограниченный, когда размер частиц сопоставим с размером пор.