Разделение и анализ биомолекул с помощью агарозного геля

Введение

Метод разделения и анализа биомолекул с использованием агарозного геля

Электрофорез в агарозном геле – это метод гелевого электрофореза, используемый в биохимии, молекулярной биологии, генетике и клинической химии для разделения смешанной популяции макромолекул, таких как ДНК или белки, в матрице агарозного геля, одного из двух основных компонентов агара. Белки могут быть разделены по заряду и/или размеру (изоэлектрическое фокусирование в агарозном геле по существу не зависит от размера), а фрагменты ДНК и РНК – по длине. Разделение биомолекул осуществляется путем приложения электрического поля для перемещения заряженных молекул через агарозную матрицу, при этом биомолекулы разделяются по размеру в агарозном геле. Агарозный гель легко приготавливать, он содержит относительно мало заряженных групп и особенно подходит для разделения ДНК в диапазоне размеров, наиболее часто встречающемся в лабораториях, что объясняет его популярность. Разделенную ДНК можно визуализировать с помощью красителя, чаще всего под ультрафиолетовым светом, и фрагменты ДНК можно относительно легко извлекать из геля. Большинство используемых агарозных гелей имеют концентрацию 0,7–2% и растворены в подходящем буфере для электрофореза.

Свойства геля агарозы

Гель агарозы представляет собой трехмерную матрицу, образованную спиральными молекулами агарозы в суперспиральных пучках, которые агрегируются в трехмерные структуры с каналами и порами, через которые могут проходить биомолекулы. Трехмерная структура поддерживается водородными связями и, следовательно, может быть разрушена при нагревании до жидкого состояния. Температура плавления отличается от температуры гелеобразования; в зависимости от источника, температура гелеобразования агарозного геля составляет 35–42 °C, а температура плавления – 85–95 °C. Также доступны агарозы с низкой температурой плавления и гелеобразования, полученные путем химической модификации. Гель агарозы обладает большим размером пор и хорошей прочностью геля, что делает его подходящим в качестве антиконвекционной среды для электрофореза ДНК и крупных белковых молекул. Размер пор 1% геля оценивается от 100 нм до 200–500 нм, а его прочность позволяет формировать пластины для гелевого электрофореза из гелей с концентрацией до 0,15%. Он также может использоваться для разделения крупных белков и является предпочтительной матрицей для гелевого электрофореза частиц с эффективными радиусами более 5–10 нм. В гель агарозы с концентрацией 0,9% могут проникать бактериофаги T4. Полимер агарозы содержит заряженные группы, в частности пируват и сульфат. Эти отрицательно заряженные группы создают поток воды в направлении, противоположном движению ДНК, в процессе, называемом электроэндосмосом (ЭЭО), и, следовательно, могут замедлять движение ДНК и вызывать размытие полос. Гели с более высокой концентрацией демонстрируют более высокий электроэндосмотический поток. Поэтому для электрофореза нуклеиновых кислот в агарозном геле обычно предпочтительна агароза с низким ЭЭО, хотя агароза с высоким ЭЭО может использоваться для других целей. Более низкое содержание сульфатов в агарозе с низким ЭЭО, особенно в агарозе с низкой температурой плавления (LMP), также полезно в тех случаях, когда ДНК, выделенная из геля, должна быть использована для дальнейших манипуляций, поскольку присутствие сульфатных примесей может повлиять на некоторые последующие процедуры, такие как лигация и ПЦР. Однако агарозы с нулевым ЭЭО нежелательны для некоторых применений, поскольку они могут быть получены путем добавления положительно заряженных групп, которые могут влиять на последующие ферментативные реакции. Электроэндосмос является причиной, по которой агароза используется предпочтительнее агара, поскольку компонент агаропектин в агаре содержит значительное количество отрицательно заряженных сульфатных и карбоксильных групп. Удаление агаропектина из агарозы существенно снижает ЭЭО, а также уменьшает неспецифическую адсорбцию биомолекул к гелевой матрице. Однако для некоторых применений, таких как электрофорез белков сыворотки, высокий ЭЭО может быть желательным, и агаропектин может быть добавлен в используемый гель.

Agarose gel is a three dimensional matrix formed of helical agarose molecules in supercoiled bundles that are aggregated into three dimensional structures with channels and pores through which biomolecules can pass. The 3 D structure is held together with hydrogen bonds and can therefore be disrupted by heating back to a liquid state. The melting temperature is different from the gelling temperature, depending on the sources, agarose gel has a gelling temperature of 35–42 °C and a melting temperature of 85–95 °C. Low melting and low gelling agaroses made through chemical modifications are also available. Agarose gel has large pore size and good gel strength, making it suitable as an anticonvection medium for the electrophoresis of DNA and large protein molecules. The pore size of a 1% gel has been estimated from 100 nm to 200–500 nm, and its gel strength allows gels as dilute as 0.15% to form a slab for gel electrophoresis. It can also be used to separate large proteins, and it is the preferred matrix for the gel electrophoresis of particles with effective radii larger than 5–10 nm. A 0.9% agarose gel has pores large enough for the entry of bacteriophage T4. The agarose polymer contains charged groups, in particular pyruvate and sulphate. These negatively charged groups create a flow of water in the opposite direction to the movement of DNA in a process called electroendosmosis (EEO), and can therefore retard the movement of DNA and cause blurring of bands. Higher concentration gels would have higher electroendosmotic flow. Low EEO agarose is therefore generally preferred for use in agarose gel electrophoresis of nucleic acids, but high EEO agarose may be used for other purposes. The lower sulphate content of low EEO agarose, particularly low melting point (LMP) agarose, is also beneficial in cases where the DNA extracted from gel is to be used for further manipulation as the presence of contaminating sulphates may affect some subsequent procedures, such as ligation and PCR. Zero EEO agaroses however are undesirable for some applications as they may be made by adding positively charged groups and such groups can affect subsequent enzyme reactions. Electroendosmosis is a reason agarose is used in preference to agar as the agaropectin component in agar contains a significant amount of negatively charged sulphate and carboxyl groups. The removal of agaropectin in agarose substantially reduces the EEO, as well as reducing the non specific adsorption of biomolecules to the gel matrix. However, for some applications such as the electrophoresis of serum proteins, a high EEO may be desirable, and agaropectin may be added in the gel used.

Факторы, влияющие на миграцию нуклеиновой кислоты в геле

На миграцию нуклеиновых кислот может повлиять ряд факторов: размер гелевых пор (концентрация геля), размер электрофорируемой ДНК, приложенное напряжение, ионная сила буфера и концентрация интеркалирующего красителя, такого как бромид этидия, если он используется во время электрофореза. Меньшие молекулы перемещаются быстрее, чем более крупные молекулы в геле, а двухцепочечная ДНК движется со скоростью, обратно пропорциональной логарифму числа пар оснований. Однако эта зависимость нарушается для очень больших фрагментов ДНК, и разделение таких фрагментов требует использования импульсного гелевого электрофореза (PFGE), который применяет переменный ток, меняющийся по направлению, и большие фрагменты ДНК разделяются по мере их переориентации в изменяющемся поле. Для стандартного электрофореза в агарозном геле более крупные молекулы лучше разрешаются при использовании геля низкой концентрации, а более мелкие молекулы – при высокой концентрации. Однако гели с более высокой концентрацией требуют большего времени для прохождения (иногда дней). На перемещение ДНК может влиять конформация молекулы ДНК; например, суперспирализованная ДНК обычно движется быстрее, чем релаксированная, поскольку она плотно свернута и, следовательно, более компактна. В типичном препарате плазмидной ДНК могут присутствовать различные формы ДНК. Электрофорез плазмид обычно показывает отрицательно суперспирализованную форму в виде основной полосы, в то время как ДНК с разрывами (открытая круговая форма) и релаксированная круговая форма проявляются в виде второстепенных полос. Скорость перемещения различных форм может изменяться в зависимости от условий электрофореза, и на подвижность более крупных циркулярных молекул ДНК размер пор геля может оказывать большее влияние, чем на линейную ДНК. Бромид этидия, интеркалирующий в циркулярную ДНК, может изменять заряд, длину и суперспирализацию молекулы ДНК, поэтому его присутствие в геле во время электрофореза может влиять на ее перемещение. Например, положительный заряд бромида этидия может уменьшить перемещение ДНК на 15%. Повреждение ДНК из-за усиления перекрестных связей также снижает электрофоретическую миграцию ДНК в зависимости от дозы. Скорость миграции ДНК пропорциональна приложенному напряжению, то есть чем выше напряжение, тем быстрее движется ДНК. Однако разрешение больших фрагментов ДНК при высоком напряжении снижается. Подвижность ДНК также может изменяться в непостоянном поле – в поле, которое периодически меняет направление, подвижность ДНК определенного размера может значительно снизиться при определенной частоте переключения. Это явление может привести к инверсии полос в гелевом электрофорезе с инверсией поля (FIGE), при котором более крупные фрагменты ДНК движутся быстрее, чем более мелкие.

A number of factors can affect the migration of nucleic acids: the dimension of the gel pores (gel concentration), size of DNA being electrophoresed, the voltage used, the ionic strength of the buffer, and the concentration of intercalating dye such as ethidium bromide if used during electrophoresis. Smaller molecules travel faster than larger molecules in gel, and double stranded DNA moves at a rate that is inversely proportional to the logarithm of the number of base pairs. This relationship however breaks down with very large DNA fragments, and separation of very large DNA fragments requires the use of pulsed field gel electrophoresis (PFGE), which applies alternating current from different directions and the large DNA fragments are separated as they reorient themselves with the changing field. For standard agarose gel electrophoresis, larger molecules are resolved better using a low concentration gel while smaller molecules separate better at high concentration gel. Higher concentration gels, however, require longer run times (sometimes days). The movement of the DNA may be affected by the conformation of the DNA molecule, for example, supercoiled DNA usually moves faster than relaxed DNA because it is tightly coiled and hence more compact. In a normal plasmid DNA preparation, multiple forms of DNA may be present. Gel electrophoresis of the plasmids would normally show the negatively supercoiled form as the main band, while nicked DNA (open circular form) and the relaxed closed circular form appears as minor bands. The rate at which the various forms move however can change using different electrophoresis conditions, and the mobility of larger circular DNA may be more strongly affected than linear DNA by the pore size of the gel. Ethidium bromide which intercalates into circular DNA can change the charge, length, as well as the superhelicity of the DNA molecule, therefore its presence in gel during electrophoresis can affect its movement. For example, the positive charge of ethidium bromide can reduce the DNA movement by 15%. DNA damage due to increased cross linking will also reduce electrophoretic DNA migration in a dose dependent way. The rate of migration of the DNA is proportional to the voltage applied, i. e. the higher the voltage, the faster the DNA moves. The resolution of large DNA fragments however is lower at high voltage. The mobility of DNA may also change in an unsteady field – in a field that is periodically reversed, the mobility of DNA of a particular size may drop significantly at a particular cycling frequency. This phenomenon can result in band inversion in field inversion gel electrophoresis (FIGE), whereby larger DNA fragments move faster than smaller ones.

Миграционные аномалии

"Смайли"-гели: этот краевой эффект возникает, когда приложенное напряжение слишком велико для используемой концентрации геля. Перегрузка ДНК замедляет миграцию фрагментов ДНК. Загрязнение – наличие примесей, таких как соли или белки, может повлиять на подвижность ДНК.

Механизм миграции и разделения

Отрицательный заряд фосфатного остова перемещает ДНК к положительно заряженному аноду при электрофорезе. Однако миграция молекул ДНК в растворе, в отсутствие гелевой матрицы, не зависит от молекулярной массы во время электрофореза. Следовательно, гелевая матрица отвечает за разделение ДНК по размерам при электрофорезе, и существует ряд моделей, объясняющих механизм разделения биомолекул в гелевой матрице. Широко признанной является модель Огстона, которая рассматривает полимерную матрицу как сито. Глобулярный белок или ДНК в виде случайной катушки перемещается через взаимосвязанные поры, и движение более крупных молекул с большей вероятностью замедляется и затрудняется столкновениями с гелевой матрицей, что позволяет разделять молекулы разных размеров в этом процессе просеивания. Однако флуоресцентная микроскопия окрашенных молекул в реальном времени показала более сложную динамику во время электрофореза: ДНК демонстрирует значительную эластичность, попеременно растягиваясь в направлении приложенного поля и затем сжимаясь в шар или зацепляясь в U-образную форму, когда она застревает в полимерных волокнах.

Общая процедура

Детали эксперимента по электрофорезу в агарозном геле могут различаться в зависимости от используемых методик, но в большинстве случаев выполняется общая процедура.

Литье геля

Гель приготавливается путем растворения порошка агарозы в подходящем буфере, таком как TAE или TBE, для использования в электрофорезе. Концентрация измеряется как вес агарозы на объем используемого буфера (г/мл). Для стандартного электрофореза в агарозном геле гель с концентрацией 0,8% обеспечивает хорошее разделение или разрешение крупных фрагментов ДНК размером 5–10 кб, а гель с концентрацией 2% – хорошее разрешение для небольших фрагментов размером 0,2–1 кб. Гели с концентрацией 1% часто используются для стандартного электрофореза. Гели с высокой концентрацией часто бывают хрупкими и могут неравномерно застывать, в то время как гели с низкой концентрацией (0,1–0,2%) хрупкие и с ними неудобно работать. Гели из агарозы с низкой температурой плавления (LMP) также более хрупкие, чем обычные агарозные гели. Агарозу с низкой температурой плавления можно использовать отдельно или одновременно со стандартной агарозой для разделения и выделения ДНК. PFGE и FIGE часто проводят с использованием гелей агарозы с высокой концентрацией.

Загрузка образцов

Когда гель застывает, гребень удаляют, оставляя лунки для загрузки образцов ДНК. Перед загрузкой в лунки образец ДНК смешивают с загрузочным буфером. Загрузочный буфер содержит плотное вещество, например глицерин, сахарозу или Фиколл, которое увеличивает плотность образца, чтобы он опустился на дно лунки. Буфер, используемый в геле, такой же, как и буфер для электрофореза в камере электрофореза, что позволяет проводить электрофорез в водной среде с использованием агарозного геля. Для оптимального разделения ДНК размером более 2 кб при стандартном гель-электрофорезе рекомендуется напряжение 5–8 В/см (расстояние в см – это расстояние между электродами, следовательно, рекомендуемое напряжение будет 5–8, умноженное на расстояние между электродами в см). Поскольку ДНК невидима при обычном освещении, ход электрофореза контролируется по цветным красителям. Ксиленцианол (светло-синий цвет) ко-мигрирует с крупными фрагментами ДНК, а бромфеноловый синий (темно-синий) – с мелкими фрагментами. К менее распространенным красителям относятся Кresol Red и Orange G, которые мигрируют быстрее бромфенолового синего. Для оценки молекулярной массы фрагментов ДНК также используют маркер ДНК. Однако следует учитывать, что размер кольцевой ДНК, такой как плазмиды, нельзя точно определить с помощью стандартных маркеров, если она не была линеаризована с помощью рестрикции; в качестве альтернативы можно использовать маркер суперспирализованной ДНК.

Окраска и визуализация

ДНК и РНК обычно визуализируются путем окрашивания бромидом этидия, который интеркалирует в большие бороздки ДНК и флуоресцирует под ультрафиолетовым светом. Интеркалация зависит от концентрации ДНК, поэтому полоса с высокой интенсивностью указывает на большее количество ДНК по сравнению с полосой с меньшей интенсивностью. SYBR Green, GelRed и другие подобные коммерческие продукты продаются как более безопасные альтернативы бромиду этидия, поскольку в тесте Эймса было показано, что он мутагенен, хотя канцерогенность бромида этидия фактически не установлена. Для SYBR Green требуется использование синего светового трансиллюминатора. ДНК, окрашенная кристаллическим фиолетовым, можно просматривать при естественном освещении без использования УФ-трансиллюминатора, что является преимуществом, однако это может не давать четкой полосы. После окрашивания бромидом этидия гель просматривается с помощью ультрафиолетового (УФ) трансиллюминатора. Ультрафиолетовый свет возбуждает электроны в ароматическом кольце бромида этидия, и когда они возвращаются в основное состояние, высвобождается свет, заставляя комплекс ДНК и бромида этидия флуоресцировать. Поэтому воздействие ДНК ультрафиолетового излучения следует ограничить. Использование большей длины волны 365 нм (диапазон УФ-А) вызывает меньший ущерб ДНК, но также производит гораздо более слабую флуоресценцию с бромидом этидия. Если в трансиллюминаторе можно выбрать несколько длин волн, для получения изображений можно использовать более короткую длину волны, а более длинную – если необходимо работать с гелем в течение длительного времени. Аппарат трансиллюминатора также может содержать устройства для захвата изображений, такие как цифровая или поляроидная камера, позволяющие сделать снимок геля или распечатать его. Для гелевого электрофореза белков полосы можно визуализировать с помощью красителей Кумасси или серебряного окрашивания.

Дальнейшие процедуры

Отдельные полосы ДНК часто используются для последующих процедур, и полосу ДНК можно вырезать из геля в виде среза, растворить и очистить. Однако загрязняющие вещества могут повлиять на некоторые последующие процедуры, такие как ПЦР, и в некоторых случаях предпочтительнее использовать агарозу с низкой температурой плавления, так как она содержит меньше сульфатов, которые могут влиять на некоторые ферментативные реакции. Гели также могут использоваться для блоттинг-техник.

Буферы

В целом, идеальный буфер должен обладать хорошей проводимостью, выделять меньше тепла и иметь длительный срок службы. Существует ряд буферов, используемых для электрофореза в агарозном геле; наиболее распространенные для нуклеиновых кислот – это Трис/Ацетат/ЭДТА (TAE) и Трис/Борат/ЭДТА (TBE). Используемые буферы содержат ЭДТА для инактивации многих нуклеаз, которым для функционирования требуется двухвалентный катион. Борат в буфере TBE может быть проблематичным, поскольку борат способен полимеризоваться и/или взаимодействовать с цис-диолами, такими как те, что содержатся в РНК. TAE обладает наименьшей буферной емкостью, но обеспечивает наилучшее разрешение для крупных молекул ДНК. Это означает необходимость использования более низкого напряжения и большего времени, но в итоге достигается лучший результат. Было предложено множество других буферов, например, борат лития (LB), изоэлектрический гистидин, буферы с подобранными значениями pK и т.д. В большинстве случаев предполагаемое обоснование – снижение тока (меньшее выделение тепла) и/или согласованная ионная подвижность, что увеличивает срок службы буфера. Трис-фосфатный буфер обладает высокой буферной емкостью, но его нельзя использовать, если ДНК, полученная в результате экстракции, будет применяться в реакциях, чувствительных к фосфатам. LB – относительно новый буфер и неэффективен при разделении фрагментов размером более 5 кб; однако, благодаря его низкой проводимости, можно использовать значительно более высокое напряжение (до 35 В/см), что сокращает время анализа при рутинном электрофорезе. Даже разница в размере всего в одну пару оснований может быть разрешена в 3% агарозном геле со средой с очень низкой проводимостью (1 мМ бората лития). Для конкретных применений могут использоваться другие буферные системы, например, барбитурат натрия или Трис-барбитурат, для электрофореза белков в агарозном геле, например, при обнаружении аномального распределения белков.

Приложения

Оценка размера молекул ДНК после обработки рестрикционными ферментами, например, при картировании рестрикционных сайтов клонированной ДНК. Оценка концентрации ДНК путем сравнения интенсивности полосы нуклеиновой кислоты с соответствующей полосой стандарта молекулярного веса. Анализ продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР), например, в молекулярно-генетической диагностике или генетическом типировании. Разделение фрагментов ДНК для выделения и очистки. Разделение рестрикционной геномной ДНК перед переносом на мембрану для саузерн-блотинга или РНК перед переносом на мембрану для нозерн-блотинга. Разделение белков, например, для выявления аномалий белков в клинической химии. Агарозные гели легко изготавливаются и с ними удобно работать по сравнению с другими матрицами, а нуклеиновые кислоты не подвергаются химическим изменениям во время электрофореза. Образцы также легко извлекаются. После завершения эксперимента полученный гель можно хранить в пластиковом пакете в холодильнике. Электрофорез проводится в буферных растворах для минимизации изменений pH, вызванных электрическим полем, что важно, поскольку заряд ДНК и РНК зависит от pH, однако слишком длительное время электрофореза может истощить буферную емкость раствора. Кроме того, различные препараты генетического материала могут мигрировать непоследовательно друг относительно друга из-за морфологических или других факторов.